CDNA如何克隆
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/24 09:59:34
CDNA如何克隆
CDNA如何克隆
CDNA如何克隆
一般用mRNA反转录地方法得到cDNA
或者从文库里直接得到cDNA
之后用PCR就可以扩增 克隆
cDNA克隆是以mRNA为原材料,经体外反转录合成互补的DNA(cDNA),再与载体DNA分子连接引入寄主细胞.每一cDNA反映一种mRNA的结构,cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布.特点是：
①有些生物,如RNA病毒没有DNA,只能用cDNA克隆；
②cDNA克隆易筛选,因为cDNA库中不包含非结构基因的克隆,而且每一cDNA克隆只含一个mRNA的信息；
③cDNA能在细菌中表达.cDNA仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息,只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息.
1.方法：
(1)DNA片段的制备：常用以下方法获得DNA片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下,用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA反转录产生cDNA.
(2)载体DNA的选择：
①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子,DNA呈环状,大小为1-200千碱基对(kb).在细胞中以游离超螺旋状存在,很容易制备.质粒DNA可通过转化引入寄主菌.在细胞中有两种状态,一是“紧密型”；二是“松驰型”.此外还应具有分子量小,易转化,有一至多个选择标记的特点.质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段,适用于构建原核生物基因文库,cDNA库和次级克隆.
②噬菌体DNA：常用的λ噬菌体的DNA是双链,长约49kb,约含50个基因,其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的,分布在噬菌体DNA两端.中间是非必需区,进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子.λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库.
M13噬菌体是一种独特的载体系统,它只能侵袭具有F基因的大肠杆菌,但不裂解寄主菌.M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子,象质粒一样自主制复,制备方法同质粒.寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体,又能方便地制备单链DNA,用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交.
③拷斯(Cos)质粒：是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子.是噬菌体－质粒混合物.此类载体分子容量大,可携带45kb的外源DNA片段.也能象一般质粒一样携带小片段DNA,直接转化寄主菌.这类载体常被用来构建高等生物基因文库.
(3)DNA片段与载体连接：DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一,方法有：①粘性末端连接,DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端,用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端.在连接酶的作用下可恢复原样,有些限制性内切酶虽然识别不同顺序,却能产生相同末端.②平头末端连接,用物理方法制备的DNA往往是平头末端,有些酶也可产生平头末端.平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来,但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接.④人工接头分子连接,在平头DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段,经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端.
连接反应需注意载体DNA与DNA片段的比率.以λ或Cos质粒为载体时,形成线性多连体DNA分子,载体与DNA片段的比率高些为佳.以质粒为载体时,形成环状分子,比率常为1∶1.
(4)引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或转染,方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上,待DNA被吸收后铺在平板培养基上,再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子,通常重组分子的转化效率比非重组DNA低,原因是连接效率不高,有许多DNA分子无转化能力,而且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大,转化困难.②转导,病毒类侵染宿主菌的过程称为转导,一般转导的效率比转化高.
PCR