植物组织培养一般的的流程

植物组织培养一般的的流程
植物组织培养一般的的流程

植物组织培养一般的的流程
植物组织培养实验基本步骤
一、母液的配置
1、MS大量元素母液的配制
一般将大量元素配制成10倍的母液,使用时再稀释10倍.按照配方表中用量依次分别称取扩大10倍的：NH4NO3 、KNO3 ,KH2PO4 、MgSO4.7H2O 、CaCl2.2H2O的量,所有药品称取完毕后用蒸馏水逐个溶解,待全部溶解后,最后定容至1000ml,转入1000ml细口试剂瓶中,贴上标签,注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名,置于4℃冰箱中保存备用.
2、MS微量元素母液的配制
一般将微量元素配制成100倍的母液,使用时再稀释100倍.按照配方表中用量分别依次称取：MnSO4 •4H2O、ZnSO4•7H2O 、H2BO3 、NaMoO4•2H2O、 CuSO4•5H2O、 CoCl2•6H2O扩大100倍的量,用蒸馏水逐个溶解,待全部溶解后,用容量瓶定容至1000ml,转入1000ml细口试剂瓶中,贴上标签,注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名,置于4℃冰箱中保存备用.
3、MS铁盐母液配制
一般将铁盐配制成100倍的母液,使用时再稀释100倍.按照配方表中用量分别称取扩大100倍的：FeSO4•7H2O和Na2•EDTA•2H2O的量,把FeSO4•7H2O和 Na2•EDTA•2H2O分别置于200ml蒸馏水中,加热并不断搅拌使之溶解（磁力搅拌器,边加热,边搅拌）.保持加热,把FeSO4溶液慢慢倒入Na2•EDTA溶液中并不断搅拌,接近沸腾时停止加热,待溶液冷却后加蒸馏水到最终容积1000ml,置于棕色细口瓶中,用力振荡1～2min,贴上标签,注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名.在室温下避光保存一段时间令其充分反应后,再置于4℃冰箱中保存备用.
4、MS有机化合物母液的配制
一般将有机化合物配制成100倍的母液,使用时再稀释100倍.按照配方表中用量分别称取扩大100倍的：肌醇、维生素B1、烟酸、甘氨酸、维生素B6的量,用蒸馏水依次溶解并定容至500ml后,转入500ml细口试剂瓶中,贴上标签,注明母液名称、配制日期、配制人姓名,置于4℃冰箱中保存备用.
二、植物激素的配置
常见激素：二氯苯氧乙酸（2,4－D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚－3－丁酸（IBA）、激动素（6-糠氨基嘌呤、 KT）、6－苄氨基嘌呤（6－BA）、赤霉素（GA3）、
1、生长素类：
（1）、生长素类在组织培养中的主要作用是：诱导细胞的分裂和根的分化,诱导愈伤组织
（2）、常见生长素：二氯苯氧乙酸（2,4－D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚－3－丁酸（IBA）.NAA、IAA、IBA被广泛用于生根,2,4－D有利于愈伤组织的诱导和生长.IAA容易光解,注意用棕色试剂瓶保存,保存时间不要太久.
（3）、溶解方法：用少量1mol/L NaOH或95％酒精预溶解,再加蒸馏水定容,以前者为好.
（4）、保存：配成一定浓度后,冰箱冷藏保存
2、细胞分裂素
组织培养中,细胞分类素主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽.细胞分裂素常常与生长素相互配合,用以调节细胞分裂,细胞伸长,细胞分化和器官形成.
（1）、常用的细胞分裂素有： 6－苄氨基嘌呤（6－BA）、激动素（6-糠氨基嘌呤、 KT）、玉米素（ZT）、噻二唑苯基脲（ thidiazuron、 TDZ ）
（2）、溶解方法：用少量（1ml）1mol/L HCL预溶解,再加蒸馏水定容.
（3）、保存：配成一定浓度后,冰箱冷藏保存
3、赤霉素（GA3）
（1）、溶解方法：用少量95％酒精预溶解,再加蒸馏水定容.
（2）、保存：配成一定浓度后,冰箱冷藏保存
（3）、赤霉素易溶于水,但溶于水后不稳定,容易分解
（4）、灭菌：高温易分解,要过滤灭菌
4、脱落酸
（1）、溶易溶于NaHCO3溶液、氯仿或丙酮.
（2）、保存：具有热稳定性,但容易发生光解.配成一定浓度后,冰箱冷藏保存
三、培养基的制备与灭菌
（一）、培养基的制备
1、将所需的各种母液和植物激素按顺序放好,将洁净的各种玻璃器皿等放在指定位置.
2、取烧杯一个内盛200ml蒸馏水,按照培养基配方所需量依次取母液和植物激素加入烧杯,搅拌,按相应培养基称量蔗糖和琼脂,并添加到烧杯中,在电炉上加热待琼脂完全融化后加蒸馏水定容至所需体积.
3、充分混合后,用1mol/LNaOH和1mol/LHCl调节培养基的pH为培养基要求pH值.
4、趁热把培养基分装到广口瓶中.封好瓶口.待灭菌.
（二）、培养基的灭菌
灭菌温度及灭菌时间：121℃（1.06kg/cm2）下灭菌20分钟.（如是实验所用菌材灭菌,如无菌水及器械,则是121℃（1.06kg/cm2）下灭菌30分钟）
1、检查灭菌锅外层锅内水位,水量过少时应加水.把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内.
2、盖上锅盖,注意按照说明操作并确定已盖好,设置好温度和时间参数,开启电源加热灭菌.
3、灭菌时间到后,先切断电源,让灭菌锅内温度自然下降,待灭菌锅压力表指针降到0时,打开排气阀,旋松螺栓,开启锅盖,取出已灭菌的培养基.
4、刚灭过菌的培养基成液体状,取出时不要用力摇动,否则会导致部分培养基沾附在瓶壁.放置在水平桌面上自然冷却.在室温下放置1-2天,观察有无微生物生长,以确定培养基是否彻底灭菌.经检查没有杂菌生长的方可使用.
四、无菌操作技术和接种
1、接种前,用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面,将培养基及接种用具放入超净工作台台面,打开超净工作台紫外灯及接种房间紫外灯,照射约30min,然后关闭紫外灯.打开房间换气扇及微开超净工作台的玻璃挡板,通风20min后,即可进行无菌操作.（此步由专人统一负责）
2、接种室灭菌过程中同时对外植体进行表面灭菌.先将接种材料在流动的自来水下涮洗干净,吸干水份后切成大约70mm长的片段放进500ml烧杯中,用蒸馏水冲洗2次,倒掉蒸馏水后倒入0.1%的升汞水消毒,将材料淹没浸泡约10分钟（期间用镊子搅拌几次）.
3、把在消毒液中的接种材料转移到超净工作台上.用无菌镊子将已完成灭菌的接种材料转移到烧杯中,用无菌水清洗3次,每次不少于1分钟,洗时不断摇动烧杯以确保完全除去消毒液.
最后一次清洗后转移到无菌托碟上,将接种材料切成一定大小（花托0.5cm2、茎段0.5-1cm）.
4、取下培养瓶的盖子用火烧灼瓶口.用镊子将外植体轻轻插入到琼脂上,立即盖上盖子.
5、操作完后将镊子等器械浸入75%酒精中.操作器械需要在每次使用前消毒一次.方法是将浸于酒精中的器械取出后置于酒精灯火焰上充分灼烧,待冷却后方可使用.
6、将培养瓶放到培养箱里,在要求温度下培养,观察记录.