植物SOD 测定方法请问 具体方案
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/06 07:34:27
植物SOD 测定方法请问 具体方案
植物SOD 测定方法
请问 具体方案
植物SOD 测定方法请问 具体方案
常用的几种SOD检测方法：
1． 分光光度法
分光光度法是最为典型的检测SOD的方法,这种方法使用了细胞色素 C(cytochrome C)或者氮蓝四唑（NBT）（图1）.用cytochrome C的还原法来检测O2-是因为还原后的cytochrome C会生成紫色的染料（图解 2）.这是自SOD被发现以来最常用的方法.
Cyt(FeⅢ) + O2- —> Cyt(FeⅡ) + O2
因为cytochrome C很容易被NADPH还原酶或者其他的还原剂所还原,因此必须要考虑样品的污染因素.而且,这种方法需要每隔1.5分钟就要察看一下,因此不适合做大批量的实验.NBT法的原理是生成不溶于水的蓝色甲臢染料(lmax:560 nm)去和O2-反应.这种染料不溶于水,在做长时程分析时会生成不均一的沉淀物,从而影响实验数据的重现性.为了得到水溶性的甲臢染料,许多改良后的方法如添加BSA被人们所采用.但是,添加了不必要的蛋白质会使数据分析变得十分复杂,而且NBT会被多种还原剂所还原.NBT的这种特性被用于酮胺的检测,酮胺可以作为糖尿病的标记物并且是Maillard反应的中间体.NBT法的最大缺点是即使加入过量的SOD也不能获得100%的抑制率,原因是NBT会与黄嘌呤氧化酶直接反应.
2． 化学发光法
用于O2-检测的化学发光探针同样也能用于SOD的检测,这种探针分为2种,一种是光泽精,另一种是荧光素衍生物（MCLA）.这种化学发光反应对pH有高度的依赖性.例如,光泽精只有在pH 9.0或者更高处会发出强烈的化学光.因此,在生理的pH条件下用这种方法检测SOD是不可行的.另一方面,MCLA在生理条件下能够发出较强的化学荧光,因此可以用于人脑的Cu,Zn-SOD活性的检测.但是,MCLA不适合用作SOD检测的探针,因为它不单单和O2-反应,还会和单质氧反应.而且MCLA与溶解氧反应后会发出化学光,转移的金属离子还会加速氧化反应.
3.电子自旋共振（ESR）光谱法
在室温下,溶液中O2-的ESR信号不能直接被检测出,但能够通过自旋捕捉法间接获得.最常见的诱捕剂是5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide(DMPO).由于O2- 诱捕DMPO会产生一个特殊的光谱图,因此ESR法是O2-检测的方法中特异性最好的一种.然而,DMPO与O2-间的二阶速度常数比O2-自发反应常数相对要低,因此需要向溶液中加入大量的DMPO（如：终浓度为0.45M）.这样,每次试验所要用的DMPO将花去大笔的经费.
这种方法的另一个问题是在实验中需要一套较为昂贵的ESR设备.
4．利用水溶性四唑盐检测SOD的新方法
为了克服上述的诸多问题,我们在做SOD检测时需要考虑如下几个方面：实验设备要简单、经济,pH灵敏度要低,对O2-有高度的特异性.如果用分光光度计作为一种简单的实验设备的话,就需要一种与cytochrome C和NBT相似的比色探针.检测中最重要的一点是在没有其他物质干扰的情况下,测定出SOD100%的抑制率.为了得到一种新的检测SOD的方法,我们对还原后能生成水溶性甲臢的四唑盐作了一系列的实验