酵母核糖核酸的分离和鉴定.实验原理

酵母核糖核酸的分离和鉴定.实验原理
酵母核糖核酸的分离和鉴定.实验原理

酵母核糖核酸的分离和鉴定.实验原理
一、\x09实验目的
1、掌握酵母RNA提取的方法.
2、了解核酸的组成.
3、掌握鉴定核酸组分的方法和操作.
二、\x09实验原理
酵母核酸中RNA含量较多,DNA则少于2%.RNA可溶于碱性溶液,当碱被中和后,可加乙醇使其沉淀,由此即可得到RNA制品.但是用碱液提取的RNA有不同的降解.RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸等组分,加入硫酸煮沸可使其水解,从水解液中可以测出上述组分的存在(见实验内容)
三、\x09实验步骤
1、\x09用托盘天平称1g干酵母于研钵中,加入少许石英砂,再加入2ml 0.04mol/LNaOH溶液,在研钵中充分研磨至少5min.
2、\x09再加4ml 0.04mol/LNaOH溶液于匀浆液中,混匀后,将匀浆液转移到大试管中,再用4ml 0.04mol/LNaOH溶液洗涤研钵,洗涤液并入匀浆液中.
3、\x09将大试管小心在沸水浴中加热30min,冷却后倒入离心管中,与另一组同学的离心管在托盘天平上平衡,然后两组的离心管对称地放入离心机中,2000r/min下离心15min.
4、\x09吸取10ml酸性乙醇溶液于小烧杯中,将离心管上清液小心倒入小烧杯中,边倒入边搅拌,直到RNA沉淀完全.
5、\x09将小烧杯中的液体倒入2个干净的离心管,平衡、离心（2000r/min）3min.
6、\x09弃去两离心管上清液,各离心管中加入95%乙醇2.5ml,振荡、混匀、平衡、离心（2000r/min）3min.
7、\x09弃去两离心管上清液,各离心管加入3ml 1.5mol/L硫酸,混匀、倒入同一个大试管中,贴上标签,放在试管架上,备用.
8、\x09将水解液在沸水浴中加热至少10min,使沉淀RNA充分水解.
9、\x09取一支试管A,加入1ml 0.1mol/L硝酸银溶液,再逐滴加入浓氨水至沉淀消失,然后加入1ml水解液放置片刻,观察有无白色嘌呤碱的银化合物沉淀.
10、\x09另取一支试管B,加入水解液1ml,三氯化铁浓盐酸溶液2ml和地衣酚乙醇溶液0.2ml（约4滴）,混匀,用试管夹夹好后放到沸水浴中3~5min,注意观察溶液是否变成绿色,说明核糖的存在.
11、\x09再取一支试管C,加入水解液1ml和定磷试剂1ml,混匀,在沸水浴中加热,注意观察溶液颜色的变化,溶液变蓝,说明磷酸存在.
注意事项：离心一定要平衡对称放入离心机中,离心机达到设置转速时才能离开.
四、\x09实验结果
第6步中离心管底部有不少的RNA沉淀.
试管A：出现白色浑浊现象.有嘌呤碱存在.
试管B：加热后,出现鲜绿色,且随着加热时间延长,颜色越来越深.有核糖存在.
试管C：加热后,出现蓝色,且随着加热时间延长,颜色越来越深.有磷酸存在.
说明RNA的组分中有嘌呤碱、核糖、磷酸.
分析：
本实验选用酵母,是因为酵母中RNA含量较多,且价格便宜.RNA可溶于碱性溶液,所以本实验用0.04mol/LNaOH溶液来提取.RNA不溶于乙醇,可用酸性乙醇使RNA从溶液中沉淀出来,再用乙醇洗涤沉淀,可得到RNA粗制品.
研磨和NaOH使酵母细胞破裂,RNA主要存在于细胞质中,所以RNA被释放出来,同时,NaOH使蛋白质变性.
加入酸性乙醇,一方面可以中和NaOH,另一方面,使RNA从溶液中沉淀下来.
RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸等组分,加入硫酸煮沸可使其水解,从水解液中可以测出上述组分的存在.
（1）、强酸使核酸分子的有机磷消化为无机磷,使之与钼酸铵结合成磷钼酸铵（黄色沉淀）
PO43- + 3NH4+ + 12MoO42- + 24H+ ===(NH4)3PO4.12MoO3.6H2O + 6H2O
当有还原剂（如维生素C）存在时,Mo6+被还原成Mo4+,再与试剂中的其它MoO42-结合成Mo（MoO4）2,呈蓝色,称钼蓝.所以试管C中会出现蓝色.
（2）、RNA与硫酸共热,生成的核糖进而脱水转化为糠醛,三氯化铁作为催化剂,可与地衣酚反应,生成绿色化合物,所以试管B中出现绿色.（OR苔黑酚）
（3）、嘌呤碱可与硝酸银反应产生白色的飘零银化合物沉淀.所以试管A中出现浑浊现象.
（4）、不检测嘧啶碱,是因为与嘌呤碱相比,它难以被水解下来,同时它难检测且现象不明显.

酵母核酸中RNA含量较多，DNA 则较少。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。
核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱、磷酸，加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可测出其组成成分。

酵母核酸中RNA含量较多，DNA 则较少。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。