【跪求】我的PCR体系应该怎么设定?退火温度?我做一种真菌的pcr,引物序列左：aatcgacccgtttccgcctt, 右：gttagattgaccgcgattcc,生工合成单给的退火温度分别是59.85和57.8我的25微升体
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/23 07:42:35
【跪求】我的PCR体系应该怎么设定?退火温度?我做一种真菌的pcr,引物序列左：aatcgacccgtttccgcctt, 右：gttagattgaccgcgattcc,生工合成单给的退火温度分别是59.85和57.8我的25微升体
【跪求】我的PCR体系应该怎么设定?退火温度?
我做一种真菌的pcr,引物序列左：aatcgacccgtttccgcctt,
右：gttagattgaccgcgattcc,生工合成单给的退火温度分别是59.85和57.8
我的25微升体系：10*buffer（含镁） 2.5
dntps 0.5
引物分别 0.5
DNA模板 1
rTaq 1U
1%琼脂糖电泳,结果DL2000和二聚体都很亮,就是没有特异性条带,请问各位大侠,我那里出了问题,退火温度,我降低5度还是没有,请问引物多和模板多,是否影响结果,镁离子是否要单加,朋友给我找找原因,我摸索2月没有结果了!
【跪求】我的PCR体系应该怎么设定?退火温度?我做一种真菌的pcr,引物序列左：aatcgacccgtttccgcctt, 右：gttagattgaccgcgattcc,生工合成单给的退火温度分别是59.85和57.8我的25微升体
根据你描述,体系可能性不大.所以给如下建议：
1.检查引物,确保正反向设计没有问题,而且最后都是从5到3顺序书写并送交合成（这种错误很低级,但有人犯过,所以提醒,如果自己不很保证就让别人把把关）.
2.再次要求生工合成引物（合错可能性有,不大）,或者重新换位置设计引物
2.由于是真菌,你用基因组还是cdna做模板?倘若后者要考虑你cdna质量是否够好.前者,那么可能内含子太多你pcr延伸时间不够?
3.尝试温度梯度pcr
4.尝试热启动pcr（特殊热启动酶,或者待遇变形快要结束时再加入taq）
5.可以考虑用不含有mg的buffer,然后可以做mg梯度pcr
感觉你的上下游引物cg含量都很高啊。
你从55度到65度做一个温度梯度试试。
模板稀释到在琼脂糖上看不出来的浓度。
也可以去这里问问。
http://bbs.bioon.com/bbs/forumdisplay.php?fid=149
用Touch Down PCR试试， 还有你确定你的模板没有问题么？ 可以尝试增加模板量，延长变性时间。
我觉得可能出问题的地方有：
1.我一般用50微升体系，dNTP要用4微升，你的dNTP用量太少了
2.引物量太多，你的体系加0.3微升引物就足够了，你加多了会形成引物二聚体
3.退火温度要比TM值低一些
4.检查你的Taq酶是否还有活性
5.最后模板也检查一下，别太着急了，每个因素都要考虑到哈...
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我觉得可能出问题的地方有：
1.我一般用50微升体系，dNTP要用4微升，你的dNTP用量太少了
2.引物量太多，你的体系加0.3微升引物就足够了，你加多了会形成引物二聚体
3.退火温度要比TM值低一些
4.检查你的Taq酶是否还有活性
5.最后模板也检查一下，别太着急了，每个因素都要考虑到哈
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