请问实时定量PCR的绘制溶解曲线应该从多少度开始升温?我的实验结果里,溶解曲线在55度时候有个小峰,请问可能是什么原因造成的?
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/27 10:02:10
请问实时定量PCR的绘制溶解曲线应该从多少度开始升温?我的实验结果里,溶解曲线在55度时候有个小峰,请问可能是什么原因造成的?
请问实时定量PCR的绘制溶解曲线应该从多少度开始升温?我的实验结果里,溶解曲线在55度时候有个小峰,请问可能是什么原因造成的?
请问实时定量PCR的绘制溶解曲线应该从多少度开始升温?我的实验结果里,溶解曲线在55度时候有个小峰,请问可能是什么原因造成的?
如果扩增产物只有目标序列的话就应该只有一个峰的.
1.简单的说来,溶解曲线就是在采用荧光染料法进行实时定量PCR时采用的一种分析手段.当体系的温度逐渐升高的时候,体系中的PCR产物慢慢的由双链变成单链,这是一个逐渐变化的过程.由于荧光染料能插入到双链DNA中而发光,单链不发光,因此可以看到荧光的变化.在实时荧光PCR仪中都应该自带分析软件,看溶解曲线主要是看其峰在什么位置,不同的核酸会有不同的峰.同一核酸的峰差别应该不大,一般能控制在正负0.5度内.
2.溶解曲线是做染料法定量pcr时,用到的一种结果分析方法.
一般染料法定量pcr在进行完pcr后都要运行熔解曲线,一般设定先94度几分钟,然后骤冷到65度（假定65度为退伙温度）.在65度时,pcr产物是以双链的形式存在的,因为染料是插到双链dna的小沟里然后发荧光的,所以这个时候检测到很强的光信号,随着温度升高,双链逐渐打开,荧光信号逐渐减弱.因为理论上要检测的样本长度一定,所以到达某一个温度的时候,应该全部解链,我们假设在88 度的时候pcr产物全部解链,这个时候就是我们在熔解曲线图上看到的所有曲线同时骤然下滑的那个点,一般把最高温设定在94度左右.如果下滑点不在一个温度,说明不是一种产物.
一般是从65度开始，升到90度左右
一般都是50到90度
55度有小峰的话很可能就是非特异扩增出的杂带，把PCR产物拿去电泳，如果是非特异条带的话，适当提高退火温度，提高2度左右，再不行就缩短退火和延伸时间