体外合成DNA方法和原理没有模板,自行设定的序列
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/19 01:09:10
体外合成DNA方法和原理没有模板,自行设定的序列
体外合成DNA方法和原理
没有模板,自行设定的序列
体外合成DNA方法和原理没有模板,自行设定的序列
现有体外合成DNA的方法主要就是PCR（即聚合酶链式反应）了
基本原理是：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径.双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝.在聚合酶链式反应实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链.因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制.
具体工作流程： 类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至40~60℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下,于72℃左右,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板.每完成一个循环需2～4分钟,2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍.
还有的话那就是利用DNA合成仪了
原理与过程：DNA的固相合成.
即DNA3'端固定于基质上,然后沿3'向5'方向依此添加核苷酸直至合成所需的DNA片段.不同于应用DNA聚合酶的DNA合成.
合成过程
第一个碱基的3‘末端固定在树脂上,下一个碱基的5’-OH用二对甲氧三苯甲基DMT保护,碱基上的氨基用苯甲酸保护,然后对3‘-OH用氨基磷酸化合物进行活化.
1.1个碱基的5’-OH和下个碱基的3‘-OH形成亚磷酸三酯,
2.然后用碘氧化成磷酸三酯
3.加入二氯乙酸除去第二个碱基5’-OH上的保护剂DMT
循环进行加入下一个碱基
合成完毕后
1.用苯硫酚除去5’-OH上的保护剂DMT
2.用浓氢氧化铵将片段与固体树脂断开,洗脱
3.用浓氢氧化铵在加热的条件下除去碱基上的保护剂
4.除去氢氧化铵,真空抽干
5.液相色谱或者PAGE,回收片段最长的.