（1）测ELISA的时候,封闭过长对结果有什么影响?（2）空白和阴性数值偏高是什么原因?
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/19 19:58:49
（1）测ELISA的时候,封闭过长对结果有什么影响?（2）空白和阴性数值偏高是什么原因?
（1）测ELISA的时候,封闭过长对结果有什么影响?
（2）空白和阴性数值偏高是什么原因?
（1）测ELISA的时候,封闭过长对结果有什么影响?（2）空白和阴性数值偏高是什么原因?
试剂的选择是保证血液检测质量的关键要素.虽然国家采用批批检定的形式对ELISA试剂严格把关,但不同厂家的试剂在使用效果上仍存在差异.要选购知名度相对高、具有“三证”的试剂,不要用无批号的试剂,最好选用与仪器配套的试剂.更不要使用过期的试剂和混用不同批号的试剂.
1.2试剂的准备
在临床实验室,对试剂的准备一般不太注意,通常的做法是在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用,而忽略了这种做法有可能影响后面时间不够的问题,其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性.因此,在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是,将试剂盒先从冰箱中拿出来,在室温下放置20～30 min后,再进行测定,使试剂盒在使用前与室温平衡,这样做的目的能使反应微孔内的温度较快地达到所需的温度,以满足后面的测定需求.
2 样本的因素
2.1内源性干扰因素
包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体等[1].
2.1.1类风湿因子在类风湿患者及正常人血清中,常含有较高或不同浓度的类风湿因子(RF),其一般为IgM型,亦有IgG和IgA型,具有与变性IgG产生非特异结合的特点,因为在ELISA测定中,其可与固相上包被的特异抗体IgG以及随后加入的酶标的特异抗体IgG结合,从而出现假阳性结果.避免其发生的方法有:①用F(ab)2替代完整的IgG.②标本用联有热变性IgG的固相吸附剂处理.③检测抗原时,可用2-巯基乙醇加入到标本稀释液中使RF降解.
2.1.2补体在固相酶免疫测定中,来自哺乳动物的固相抗体和酶标二抗均有激活人补体系统的功能.一方面,固相抗体和酶标二抗可因其吸附及结合过程中抗体分子发生变构,使Fc段的补体C1q结合点暴露出来,使C1q成为一个中介物将二者交联起来出现假阳性结果.另一方面,固相抗体也会因为活化补体的结合,封闭抗体和抗原的表位结合能力而引起假阴性.解决的办法是:①用EDTA稀释标本.②56℃ 30 min加热血清使C1q灭活[1,2].
2.2外源性干扰因素
包括标本溶血、标本被细菌污染、标本保存时间过长和标本凝固不全等.
2.2.1标本的溶血血红蛋白中含铁血红素有类过氧化物酶的活性,因此,在以辣根过氧化物酶(HRP)为标志的ELISA测定中,如血清样本中血红蛋白浓度较高,则很容易在温育过程中吸附于固相,从而与后面加入的HRP底物反应显色.所以在采血时应注意手法,采集的血液勿用力振荡,严防标本溶血.
2.2.2标本的污染菌体可能含有内源性辣根过氧化物酶,可使实验出现非特异性显色.因此,ELISA检测宜采集新鲜标本,如不能当时测定,5 d之内应4℃保存,1周后检测应低温冻存;同时,收集标本采用无菌试管,可防止标本的污染.
2.2.3标本的保存标本在冰箱中保存过久,血清中IgG可聚合成多聚体,AFP可形成二聚体,在用间接法测定中会导致本底过深,甚至造成假阳性.冰冻保存的标本反复冻融产生机械剪切力对标本中的蛋白等分子有破坏作用,可引起假阴性结果.因此,ELISA检测尽量采用新鲜标本,长时冻存的样本避免反复融冻[3].
2.2.4标本凝固不全凝固不全的血清中含有部分纤维蛋白原,可使结果呈假阳性.解决的方法有:①于采血管中加入适当的抗凝剂;②将采集后的血液放在架子上再放入37℃水浴中1 h,待充分凝固后再离心分离血清[4].