大肠杆菌染色体DNA的制备实验
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/07 23:41:46
大肠杆菌染色体DNA的制备实验
大肠杆菌染色体DNA的制备实验
大肠杆菌染色体DNA的制备实验
【实验目的】
1.学习并掌握细菌基因组的提取方法
【实验原理】
DNA是一个环形的大分子DNA,真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内.不同种属的生物,以及不同形式的细胞（如菌类、培养细胞、植物组织,动物组织）基因组提取的方法是不同的,但其基本原则是类似的,即既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离,又要保持DNA分子的完整.提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出.SDS的作用机理是由于其能结合蛋白,中和蛋白的电性,使蛋白质的非共价键受到破坏,失去二级结构,从而变形失活,蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性.在匀浆后提取DNA的反应体系中,SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分离出来.CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中（（0.7 mol/L NaCl）是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时,从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白,多糖类物质分开.最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA,而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去.
【实验材料】
大肠杆菌DH5α菌液
【实验试剂】
LB液体培养基,TE溶液,10%SDS,蛋白酶K,5mol/L NaCl, CTAB/NaCl溶液,酚/氯仿/异戊醇,异丙醇,70%乙醇
【实验仪器与用具】
微量移液器,低温离心机,水浴锅,eppendorf管,恒温摇床
【实验步骤】
（1）将2mL培养至对数期的大肠杆菌DH5α菌液5000rpm冷冻离心10min弃上清；
（2）加190μL TE悬浮沉淀,并加10μL 10%SDS,1μL 20mg/mL蛋白酶K,混匀,37℃保温1h；
（3）加30μL 5mol/L NaCl,混匀；
（4）加30μL CTAB/NaCl溶液,混匀,65℃保温20min；
（5）加入300μL酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提,5000rpm离心10min,将上清液移至干净离心管；
（6）加入300μL氯仿/异戊醇（24：1）抽提,取上清液移至干净管中；
（7）加300μL异丙醇,颠倒混合,室温下静止10min,沉淀DNA；
（8）5000rpm离心10min,沉淀DNA,加入500μL70%乙醇,5000rpm离心10min,弃乙醇,吸干；
（9）溶解于20μLTE,取3μL 用于琼脂糖凝胶电泳验证,其余-20℃保存.
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