求初代消化培养法、初代组织块培养法和传代培养法的操作步骤
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/23 09:52:14
求初代消化培养法、初代组织块培养法和传代培养法的操作步骤
求初代消化培养法、初代组织块培养法和传代培养法的操作步骤
求初代消化培养法、初代组织块培养法和传代培养法的操作步骤
博凌科为1）初代消化培养法1.准备：取各种 已消毒的培养用品置于净化台面,紫外线消毒20分钟.开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部.2.布局：点燃酒精灯,安装吸管帽.3.处理组织：把组织块置于烧杯中,用Hanks液漂洗2~3次,去除血污；如怀疑组织可能污染,可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟.4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块,以便于消化.加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角烧瓶中,结扎瓶口或塞以胶塞.5.消化：或用恒温水浴,或置于37℃温箱消化均可,消化中每隔20分钟应摇动一次,如用电磁恒温搅拌器消化更好.消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定.6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时,可用吸管吸出少许消化液在镜下观察,如组织已分散成细胞团或单个细胞,立即终止消化,随即通过适宜不锈钢筛,滤掉尚 未充分消化开的组织块.低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟,吸出上清,加入适量含有血清的培养液.7.计数：用计数板计数,如细胞 悬液细胞密度过大,再补加培养液调整后,分装入培养瓶中.对大多数细胞来说,pH要求在7.7.4范围,培养液呈微红色,如颜色偏黄,说明液体变酸,可用NaHCO3调整.8.培养：置于36.5℃温箱培养,如用CO2温箱培养,瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞,纱布塞易生霉菌,每次换液时需要 换新塞.2）初代组织块培养法1.剪切：把组织小块置于小烧杯或 青霉素小瓶中,用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污,吸静Hanks液,用眼科剪反复剪切1mm3块为止.2.摆布：用弯头吸管吸取若干小 块,置于培养瓶中,用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部,小块相互距离以0.5cm为宜,每一25ml培养瓶底可摆布20~30块.3.轻轻翻 转培养瓶,另瓶底向上,注意翻瓶时勿另组织小块流动,塞好瓶塞,置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时）,使小块微干涸.4.培养：从微 箱中取出培养瓶,开塞,46度斜持培养瓶,箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许,然后缓缓再把培养瓶翻转过来,让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块.置温箱中 静止培养.待细胞从组织块游出数量增多后.再补加培养液.3）传代培养法1.吸除培养瓶内旧培养液.2.向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许,以能覆满瓶底为限.3.置温箱中2~5分钟,当发现细胞质回缩,细 胞间隙增大后,立即终止消化.4.吸除消化液,向瓶内注入Hanks液数毫升,轻轻转动培养瓶,把残余消化液冲掉.注意加Hanks液冲洗细胞 时,动作要轻,以免把已松动的细胞冲掉流失,如用胰蛋白酶液单独消化,吸除胰蛋白酶液后,可不用Hanks液冲洗,直接加入培养液.5.用吸管吸 取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞,使之从瓶壁脱离形成细胞悬液.6.计数板计数后,把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中,置温箱中培养.