PCR反应的引物有何种要求?

PCR反应的引物有何种要求?
PCR反应的引物有何种要求?

PCR反应的引物有何种要求?
PCR引物设计的11条要求
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计.
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的.在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment）,各基因相同的序列就是该基因的保守区.
2.引物长度一般在15~30碱基之间.
引物长度（primer length）常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应.
3.引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好接近72℃.
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应.上下游引物的GC含量不能相差太大.另外,上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度.有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃.若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳.
4.引物3′端要避开密码子的第3位.
如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率.
5.引物3′端不能选择A,最好选择T.
引物3′端错配时,不同碱基引发效率存在着很大的差异,当末位的碱基为A时,即使在错配的情况下,也能有引发链的合成,而当末位链为T时,错配的引发效率大大降低,G、C错配的引发效率介于A、T之间,所以3′端最好选择T.
6. 碱基要随机分布.
引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错误引发（False priming）.降低引物与模板相似性的一种方法是,引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在.尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发.
7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列.
引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性.这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合.引物自身不能有连续4个碱基的互补.
两引物之间也不应具有互补性,尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成.引物之间不能有连续4个碱基的互补.
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话,应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）.否则易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行.
8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高,而3′ 端△G值较低.
△G值是指DNA 双链形成所需的自由能,它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性,△G值越大,则双链越稳定.应当选用5′ 端和中间△G值相对较高,而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物.引物3′ 端的△G 值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应.（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）
9.引物的5′端可以修饰,而3′端不可修饰.
引物的5′ 端决定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大.因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性.引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等.
引物的延伸是从3′ 端开始的,不能进行任何修饰.3′ 端也不能有形成任何二级结构可能.
10. 扩增产物的单链不能形成二级结构.
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域.用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构,有助于选择模板.实验表明,待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol时,扩增往往不能成功.若不能避开这一区域时,用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的.
11. 引物应具有特异性.
引物设计完成以后,应对其进行BLAST检测.如果与其它基因不具有互补性,就可以进行下一步的实验了.

引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。...

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引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

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