RT-PCR与时时PCR的原理及引物有什么区别?
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/22 18:02:56
RT-PCR与时时PCR的原理及引物有什么区别?
RT-PCR与时时PCR的原理及引物有什么区别?
RT-PCR与时时PCR的原理及引物有什么区别?
RT-PCR和一般的PCR相比原理上没有太多的区别,无非就是在反转时候RNA的定量,不同模板的设定.对引物没有特别的要求,能特异代表目的基因就行.
real-time PCR根据原理的不同,引物选择也不同.通常用的是SYBR Green的方法,这种方法引物在RT-PCR的基础上需要注意：1.退火温度同内参；2.片段长度不要超过200；
real-time PCR的引物可以跑RT-PCR,反之不一定.
RT-PCR就是将RNA先反转录为cDNA，在将转录得到的cDNA作为模板进行PCR反应扩增目标片段。用于反转录的引物根据实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT及基因特异引物的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA三种都可。
随机引物：适用于长的具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。
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RT-PCR就是将RNA先反转录为cDNA，在将转录得到的cDNA作为模板进行PCR反应扩增目标片段。用于反转录的引物根据实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT及基因特异引物的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA三种都可。
随机引物：适用于长的具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。
Oligo dT：适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长cDNA合成量大大减少。
基因特异引物：与模板序列互补，适用于目的序列已知的情况。
实时PCR也就是qPCR的基本原理与PCR也是一样的，只是在体系中加入荧光指示，可以对PCR的模板进行定量。
一种是加入荧光染料SYBR Green，SYBR Green会嵌入双链DNA的小沟，且只有在嵌入小沟时才会发出荧光，荧光定量PCR没进行一个循环就会对产物进行一次检测，通过检测每个循环后荧光强度（间接得知DNA的量）从而检测整个PCR的过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。SYBR Green不具有特异性，对结果稍有影响。
另一种是加入荧光探针Taq man，PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taqman探针在PCR体系中会与目标片段杂交，而在PCR的Extension阶段Taq酶以一条链为模板合成目标片段，此时Taq酶的5'－3'外切酶活性将结合在模板上的探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。Taq man 特异性强，只有被扩增出目标片段时，才有荧光发出，但是价格昂贵。
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一楼的~real-time PCR不就是RT-PCR吗？！实时定量PCR