能不能指点一下简并引物怎么设计

来源：学生作业帮助网编辑：六六作业网时间：2024/11/16 18:50:10

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能不能指点一下简并引物怎么设计
① 引物应在核酸系列保守区内设计并具有特异性.
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源.
② 产物不能形成二级结构.
某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域.
③ 引物长度一般在15~30碱基之间.
④ G+C含量在40%~60%之间.
⑤ 碱基要随机分布.
引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在.尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发.
⑥引物自身
引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性.这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合.若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp.
⑦引物之间
两引物之间不应不互补性,尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成.一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性.
⑧ 引物5′端可以修饰.
引物的5′端限定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大.因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性.引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等.
⑨ 引物3′端不可修饰.
引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰.3′端也不能有形成任何二级结构可能,除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中,引物3′端不能发生错配.
⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位.
如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率.

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