要做PCR的血液标本如何保存我是要从全血中提取基因组DNA，直接加抗凝剂-20度保存全血可以吗？必需用梯度分离液把细胞分离出来保存细胞吗
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/16 02:34:13
要做PCR的血液标本如何保存我是要从全血中提取基因组DNA，直接加抗凝剂-20度保存全血可以吗？必需用梯度分离液把细胞分离出来保存细胞吗
要做PCR的血液标本如何保存
我是要从全血中提取基因组DNA，直接加抗凝剂-20度保存全血可以吗？必需用梯度分离液把细胞分离出来保存细胞吗
要做PCR的血液标本如何保存我是要从全血中提取基因组DNA，直接加抗凝剂-20度保存全血可以吗？必需用梯度分离液把细胞分离出来保存细胞吗
最好是用淋巴细胞分离液把单个核细胞分离出来,然后-80℃保存.
外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）的分离是免疫学研究中的一项基本技术.目前国内外分离PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法（ficoll-hypaque density gradient centrifugation）,用此方法分离PBMC纯度可达95％,淋巴细胞约占90％,其中T淋巴细胞占80％,B淋巴细胞占4～10％.ficoll-hypaque混合溶液,又称淋巴细胞分层液,在分离人PBMC时,要求其比重为1.077；分离小鼠单个核细胞时比重为1.080；分离大鼠单个核细胞时比重为1.084～1.087；分离马单个核细胞时比重为1.090.
【原理】
血液中各有形成分的比重存在差异,利用比重为1.077、近于等渗的ficoll-hypaque混合溶液（又称淋巴细胞分层液）作密度梯度离心时,各种血液成分将按密度梯度重新聚集.血浆和血小板由于密度较低,故悬浮于分层液的上部；红细胞与粒细胞由于密度较大,故沉于分层液的底部；PBMC密度稍低于分层液,故位于分层液界面上,这样就可获得PBMC.
【器材与试剂】
1.刻度离心管、吸管、试管、毛细吸管、橡皮乳头、载玻片、盖玻片、离心机等.
2.pH7.2 Hanks液、肝素、生理盐水溶液,淋巴细胞分层液.
【方法】
1.静脉取血2ml,加入含肝素溶液(10～50u／m1血样本)的试管中,混匀,使血液抗
凝.用pH7.2 Hanks液将抗凝血稀释1倍.
2.吸取2ml淋巴细胞分层液置于刻度离心管中,然后将离心管倾斜45O角,用毛细滴管将稀释的全血沿管壁缓慢加至分离液上面,应注意保持两者界面清晰.
3.在18℃～20℃下,用水平离心机以2000r/min离心20min.离心后细胞分布如图.
4.用毛细吸管轻轻插到混浊带,沿管壁轻轻吸出此层细胞,移入另一支离心管中.即要吸取所有单个核细胞,又要避免吸取过多的分层液或血浆,以免混入其他细胞成分.
5.用Hanks液洗涤细胞3次.第一次2000r/min ,10 min；第2～3 次1500r/min ,10 min,可去掉大部分混杂的血小板.
6.将沉淀细胞悬于培养基中备用.
【注意事项】
1、实验所用玻璃器皿应该洁净.如果制备的单个核细胞悬液用于细胞培养时,上述操作过程都要在无菌条件下进行,所用器材、试剂都应为无菌.
2、实验中的细胞得率与室温及分层液比重等有关.分层液应避光4℃保存.
3、往淋巴细胞分层液中加入稀释全血时,不得将血液冲入分离液中,须保持两层液体的清晰界面.