细菌活体浓度如何测定,单位mg/L,不用平板计数法

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细菌活体浓度如何测定,单位mg/L,不用平板计数法

细菌活体浓度如何测定,单位mg/L,不用平板计数法
比浊法.在测计固氮细菌时,可用凯氏定氮法测定有机氮（或是蛋白态氮）,然后换算成细菌数.进行活菌计数时,先把样品稀释,然后将一定量稀释样品混入依菌性质制成的溶融状态的琼脂培养基中进行平面培养,再根据菌落数进行统计.对已鉴别过的菌种或具有某种特定性质的细菌来说,活菌计数比较简单,但对土壤微生物区系量的分析就比较复杂了.

血细胞计数法???用伊红美蓝作指示剂

必须要用平板计数，其他什么吸光度、细胞计数，都是包括了死亡菌体。

在微生物学研究中,经常需要测定培养溶液中细菌数量,比色法和比浊法是常用的方法,细菌培养液中含有活的和死的细菌、未利用完的培养基以及细菌生长过程中的代谢产物等,因此,培养液的吸光度值并不完全是细菌(活细菌、死细菌)数量的真实体现。作者比较了2 种方法(细菌培养原液、培养液离心后沉淀+ 无菌水) 测定培养液中细菌数的差异和对细菌生长曲线测定结果的影响,以期为液体培养条件下细菌数的快速测定提供参考。

全部展开

在微生物学研究中,经常需要测定培养溶液中细菌数量,比色法和比浊法是常用的方法,细菌培养液中含有活的和死的细菌、未利用完的培养基以及细菌生长过程中的代谢产物等,因此,培养液的吸光度值并不完全是细菌(活细菌、死细菌)数量的真实体现。作者比较了2 种方法(细菌培养原液、培养液离心后沉淀+ 无菌水) 测定培养液中细菌数的差异和对细菌生长曲线测定结果的影响,以期为液体培养条件下细菌数的快速测定提供参考。
1 材料与方法
1. 1 试验用菌株
由患烂爪病的中华鳖血液中分离所得,并经检验为气单胞菌属嗜水产气单胞菌种。
1. 2 细菌培养
①选用不同pH 值的营养肉汤培养基。在预先标号的试管中分别加入不同pH 值(pH 值设定为4. 5 、5. 0 、5. 5 、6. 0 、6. 5 、7. 0 、7. 5 、8. 0 、8. 5 、9. 0 、9. 5 、10. 0 、10. 5 、11. 0 共13 组) 的培养基5mL ,121. 5 ℃灭菌30 min ,然后在每支试管中加入经24 h 复壮培养的均匀菌悬液100μL ,30 ℃、140 r/ min 振荡培养24 h ,待测; ②连续培养,定期
采样。使用500 mL 锥形瓶,普通肉汤培养基,培养方法同①,培养过程中间隔1 h 连续采样。
1. 3 细菌浓度与吸光值的相关性计算
活细菌数测定采用稀释平板法,细菌总数测定采用血球计数板在显微镜下直接计数。对细菌悬液吸光值的测定采取3 种方法进行: ①以原培养基作对照,在420 nm 处直接测定细菌悬液吸光值(记ODa) ; ②将培养后的细菌悬液离心(3 000r/ min、30 min) ,取沉淀加入与上清液等量的无菌生理盐水,混匀后,以无菌盐水作对照,测定溶液吸光值(记ODb) ; ③以原培养基作对照,测定离心后上清液的吸光值(记ODc) 。参照Lambert2Beer 定律logI0/ I = k·C(其中logI0/ I 为吸光度、C为细菌浓度) ,计算活菌数和细菌总数与对应溶液吸光值的关系,并求出常数k 。
2 结果与分析
2. 1 不同pH值条件下细菌悬液的吸光值
测定不同pH 条件下的细菌培养悬液吸光度与离心沉淀+ 无菌盐水的吸光度值是两条不同的曲线,离心上清液的吸光值也不是1 条与横坐标重叠或平行的直线。说明在培养基中除细菌影响吸光值大小外,不同培养条件下的培养基质对吸光值的影响也不尽相同。
2. 2 连续培养过程中细菌悬液吸光值的变化
细菌在连续培养21 h 过程中,间隔1 h 连续测得细菌培养原液、培养液离心上清液及培养液沉淀+ 等量无菌水在420 nm 处的吸光值。2 种菌悬液(培养液,离心沉淀+ 无菌盐水) 的吸光值变化趋势一致,但在数量上存在一定差异。在细菌培养过程中不断有培养液组份消耗和细菌代谢产物增加,同时死亡细菌的消融产物也会对离心上清液的吸光值产生影响。因此,显示
出上清液随时间延长吸光值不断增加。试验中也发现,上清液颜色随培养时间延长变化明显,由棕黄色逐步变为浅黄色。
2. 3 细菌浓度与吸光值的关系
连续培养细菌5 h 后,在420 nm 处测定2 种菌悬液(培养原液,培养液离心后经无菌盐水定容) 的吸光值分别为0. 519 和0. 368 。经1/ 10 梯度稀释后采用平板法计数,培养液中活细菌数为5. 082 ×1023个/ mL ,根据Lambert2Beer 定律,2 种方法测得的活细菌数与吸光度的关系分别为
logI0/ I = 1. 021 ×10 - 24 ·C , logI0/ I = 7. 241 ×10 - 25·C。显微计数培养液中细菌总数为5. 285×1024 ,是其中活菌数的10. 4 倍,证明在细菌培养液中存在大量已经死亡的细菌。
3 讨 论
在比浊法测定细菌浓度时,有的方法采用未接种的液体培养基作为空白对照[1 ,3 ] ,但是,在细菌的生长过程中培养基质与原培养基并不完全一致。本实验结果证实:不同细菌浓度培养物经离心沉淀后,上清液的吸光度并不完全相等,即使使用原培养基作为空白对照,也不能完全消除不同培养时期或不同培养条件下培养基对吸光度的影响。死细菌对液体环境中细菌浓度的测定也有一定影响,试验对原培养液进行稀释培养和显微计数的结果差异明显,说明培养液离心沉淀物中存在大量死的细菌。活的和死的细菌之间的比例与培养条件、细菌接种量及培养时间等密切相关,如何消除这些影响,作者认为在研究细菌生长特性时应区分活细菌和细菌总数与吸光度的关系。
希望我的回答可以为你提供一些帮助~O(∩_∩)O~
我个人认为，在实验并不需要浓度有多么精确的前提下，可以利用分光光度法测定活菌浓度。

收起

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