构建全长cDNA文库哪个试剂盒比较好
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/28 13:23:50
构建全长cDNA文库哪个试剂盒比较好
构建全长cDNA文库哪个试剂盒比较好
构建全长cDNA文库哪个试剂盒比较好
———高质量、全长、高基因代表度的cDNA文库构建试剂盒
● 通过SMARTTM cDNA合成技术获得全长cDNA
● 无需接头连接直接进行cDNA克隆
● 可方便快速的将文库插入片段转移到多种Cretor表达载体中,进行功能学研究
● 起始材料可以是ng级的Total RNA或者PolyA+ RNA
技术原理：
采用的是SMART cDNA合成技术,详细的技术原理与技术优势请参阅“SMART cDNA合成技术简介”.图1.中列出了“SMART文库构建试剂”与“常规文库构建”的比较.
技术路线：
Clontech推出的两个文库构建试剂盒操作流程都非常的简便、流畅.首先通过SMART技术得到全长的双链cDNA,再通过限制酶Sfi酶切后,可直接连接到文库载体中.操作流程如图2所示.
两款试剂盒可供选择
Clontech推出了两款cDNA文库构建试剂盒,分别为：SMART cDNA Library Construction Kit（编号：634901）；Creator SMART cDNA Library Construction Kit（编号：634903）.两种文库构建试剂盒采用的技术原理是一样的,区别仅在于选用的文库载体不同：634901选用的是噬菌体载体λTripIEx2；634903采用的是质粒载体pDNR-LIB.
两个方案可以采用
一个是对于只有少量RNA的研究人员设计的；另一个是对于有大量RNA材料来设计的.第一个方法中仅需要50 ng的总RNA,需要一步长距离PCR步骤.第二个方案中,当实验材料是1μg或者更多的Poly A+ RNA时,用引物延伸的方法代替长距离PCR.
后续操作方便
通过这两款试剂盒构建的cDNA文库得到的插入片段可以方便的通过Cre-LoxP重组介导转化到多种表达载体中,从而方便的进行功能学分析.请参阅“Creator克隆和表达系统简介”.
cDNA 文库构建的基本原理与方法
cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合.经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆转录引物,或者用随机引物,给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头,连接到适当的载体中获得文库.其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法,盐酸胍—有机溶剂法,热酚法等等,提取方法的选择主要根据不同的样品而定),要构建一个高质量的 cDNA 文库,获得高质量的 mRNA 是至关重要的,所以处理 mRNA 样品时必须仔细小心.由于 RNA 酶存在所有的生物中,并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境,因此建立一个无 RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要.在获得高质量的 mRNA 后,用反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链,cDNA 第2链的合成(用 RNA 酶 H 和大肠杆菌 DNA 聚合酶 I,同时包括使用 T4 噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌 DNA 连接酶进行的修复反应),合成接头的加入、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插入片断,扩增 cDNA 文库、对建立的 cDNA 文库进行鉴定.这里强调的是对载体的选择,常规用的是 λ 噬菌体,这是因为 λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端,可用来构建柯斯质粒,这种质粒能容纳大片段的外源 DNA.