cDNA文库必须满足什么条件?其构建包括哪些步骤?

来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/29 07:10:20
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cDNA文库必须满足什么条件?其构建包括哪些步骤?
条件：1 、要使用mRNA经过反转录PCR产生cDNA.
2 、要进一步获得cDNA全长
3 、加适当接头,连接到适当的载体内.
4 、转化受体细胞,构建为cDNA文库.
基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法,盐酸胍—有机溶剂法,热酚法等等,提取方法的选择主要根据不同的样品而定),要构建一个高质量的cDNA 文库,获得高质量的mRNA 是至关重要的,所以处理mRNA 样品时必须仔细小心.由于RNA 酶存在所有的生物中,并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境,因此建立一个无RNA 酶的环境对于制备优质RNA很重要.在获得高质量的mRNA 后用反转录酶Oligo(dT) 引导下合成cDNA 第1链,cDNA 第2链的合成(用RNA酶H和大肠杆菌DNA 聚合酶I,同时包括使用T4噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌DNA连接酶进行的修复反应),合成接头的加入、将双链DNA克隆到载体中去、分析cDNA插入片断.扩增cDNA 文库、对建立的cDNA文库进行鉴定.这里强调的是对载体的选择,常规用的是λ 噬菌体,这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端,可用来构建柯斯质粒,这种质粒能容纳大片段的外源DNA.

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