我想克隆一个基因.先进行PCR,PCR产物纯化回收,然后连接,转化,一直不成功.回收的片段很亮.我用的是Ex TAQ,他的加A尾效率应该很高了,做T-A克隆应该没有问题,但就是不成功.我还做了平行试验,con
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2025/01/01 02:35:08
我想克隆一个基因.先进行PCR,PCR产物纯化回收,然后连接,转化,一直不成功.回收的片段很亮.我用的是Ex TAQ,他的加A尾效率应该很高了,做T-A克隆应该没有问题,但就是不成功.我还做了平行试验,con
我想克隆一个基因.先进行PCR,PCR产物纯化回收,然后连接,转化,一直不成功.回收的片段很亮.
我用的是Ex TAQ,他的加A尾效率应该很高了,做T-A克隆应该没有问题,但就是不成功.我还做了平行试验,control DNA长的很好,
以上回答者分析的原因都可以导致克隆不成功，但是这些原因在我的实验中都已经排除了...有没有高手分析一下深层次的原因？
我想克隆一个基因.先进行PCR,PCR产物纯化回收,然后连接,转化,一直不成功.回收的片段很亮.我用的是Ex TAQ,他的加A尾效率应该很高了,做T-A克隆应该没有问题,但就是不成功.我还做了平行试验,con
首先你有计算载体和插入DNA的摩尔比么?一般要求目的DNA片段的摩尔数远大于载体摩尔数的,我们常用的是十倍左右.然后,你连接时间有多长?如果按照推荐的16度半小时的话,过长的片段往往连接效率非常低.你最好试试延长连接时间,我们的做法都是连接过夜的.还有就是你的插入DNA片段有多长?过长的片段有时候很难转进去,而且过长的片段加A尾有时候也不完全,这和酶没有多少关系,你需要延长延伸时间.PS：TA克隆这种事情很神奇的,你最好叫会做的人带你做一次,不然乱七八糟的情况真的非常多.我当时自己一个人摸索的,用了一个多月才做出来.你努力.
1，目的片断是否过长？
2，使用的T 载体和连接时间，一般要温度是当低一点，时间长一些。
你也是老手了，300bp的片段连接也是小意思，基本的问题就不谈了：
1，不成功是怎么不成功，假阳性？如果是这样，多挑点（20个）鉴定
2，试试培养基中加1%葡萄糖，以及将片段末端磷酸化试试，都能提高连接和转化效率。
我觉得，片段与载体比例不是根本原因，300bp很好连，而且是T载体，就算比例比较夸张，对你这样的老手也不会转不出阳性。如果你的片段有酶切位点，直接酶切连目标载体...
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你也是老手了，300bp的片段连接也是小意思，基本的问题就不谈了：
1，不成功是怎么不成功，假阳性？如果是这样，多挑点（20个）鉴定
2，试试培养基中加1%葡萄糖，以及将片段末端磷酸化试试，都能提高连接和转化效率。
我觉得，片段与载体比例不是根本原因，300bp很好连，而且是T载体，就算比例比较夸张，对你这样的老手也不会转不出阳性。如果你的片段有酶切位点，直接酶切连目标载体试试。
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是不是应该对你的序列本身进行一下分析呢？有些序列本身很特别就不能按照常规的程序拉。