克隆未知基因的方法有哪些?
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/09 04:40:05
克隆未知基因的方法有哪些?
克隆未知基因的方法有哪些?
克隆未知基因的方法有哪些?
克隆方案(以拟南芥为例）
(1)建立拟南芥诱变群体.
采用拟南芥的化学诱变方法进行诱变处理：将约250mg野生型拟南芥种子用乙基甲磺酸（EMS）处理,得到M2代种子,供突变体筛选使用.该方法的优点是诱变率较高,操作过程比较简单.
(2)突变体的筛选.
首先,确定合适的筛选条件.筛选条件是相对于野生型的正常培育条件而言的,一般根据目的性状表达所需的条件来确定.
（3）突变体的遗传分析
相对于某一目的性状的理想突变体最好是单基因突变体,即突变体所发生的性状变异是与单个基因发生突变相连锁的.因此,应对经上述过程筛选得到的突变体进行进一步的遗传学分析.采取两种方案：
第一,将突变体材料连续多代种植（自交）,以观测其突变性状是否具有遗传稳定性.
第二,通过回交,分析其子二代（F2）的目的性状（表型）的分离情况（即是否符合3：1或1：3）等.
（4）突变体突变基因的定位与克隆
获得突变体后,可利用该突变体克隆与性状相关的功能基因/调控基因.基本实验方案包括三个方面：
第一,作图群体的构建.首先将突变体与另一生态型的野生型拟南芥植株进行杂交,然后利用F2代筛选仍然表现突变性状的植株构成作图群体.
第二,突变基因的染色体定位.根据SSLP分子标记方法,在五条染色体上选择若干个已知的SSLP类分子标记用于基因的染色体粗定位.即以所选择的已知分子标记为引物对F2代作图群体植株DNA分别进行PCR扩增及产物电泳检测,根据产物多态性出现的几率可以计算出目的基因与已知分子标记的遗传距离,从而将目的基因大致定位在染色体的某一区段内.
第三,利用染色体步移法逐步逼近目的基因.在基因粗定位的基础上,为了进一步的缩小突变基因存在的范围,采取染色体步移（chromosome walking）,逐步逼近目的基因.即在与目的基因更为接近的区域内,利用或重新设计新的分子标记继续电泳检测,计算目的基因与分子标记的遗传距离,直到将目的基因定位在很小的一段DNA序列范围内.然后,分析该段的DNA序列,确定目的基因序列.
（5）突变基因功能研究
第一,利用基因转移方法将克隆的目的基因转移到突变体植株中进行性状恢复实验,分析其在抗旱性方面的主体功能.
第二,利用GUS基因染色法分析目的基因在植株体内的表达部位,以进一步揭示其作用范围.
第三,围绕目的基因编码的代谢产物与植物抗旱性间的关系,从植物形态、生理生化等方面进一步分析其具体功能.