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您好,我还有个问题,克隆载体表达蛋白量很小,为什么很多实验还是采用,克隆载体与基因片段重组,然后导入到动物体内,这么做呢?

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转基因动物模型是联系分子、细胞水平研究和整体动物研究的桥梁自1980年Gordon首次采用原核显微注射开展动物转基因研究以来,已有十多种主要的转基因动物制作方法,如原核显微注射法、逆转录病毒侵染法、精子介导法、胚胎干细胞法,体细胞核移植法等这些转基因动物制备方法各有优缺点原核显微注射法制作转基因动物DNA整合效率低,整合位点不定,技术难度大,应用于高等哺乳动物时的效率很低精子介导基因转移技术技术存在随机性和不确定性胚胎干细胞法制备的转基因首建动物一般是嵌合体,不易实现外源基因的自然繁殖传代,且建立干细胞系的难度较大,应用受到限制体细胞核移植法操作难度大,且外源基因的表达与否受整合位点附近基因的影响 相对而言,慢病毒侵染法在可操作性、胚胎发育率、移植妊娠率、目的基因整合效率、目的基因表达率、阳性个体的选育等方面比上述几种技术均有显著的优势1976年,Jaenish首次用逆转录病毒Retroviruses感染胚胎制作转基因动物获得成功逆转录病毒的RNA进入细胞后,逆转录成DNA前病毒,利用逆转录病毒的整合酶及其特异的末端核苷酸序列,将DNA前病毒整合到染色体上,从而将其携带的外源基因也插入到染色体上慢病毒lentivirus属逆转录病毒的亚科,具有逆转录病毒的基本结构gag、pol和env,不同之处在于慢病毒包含4个辅助基因,vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev其中调节基因tat和rev分别编码两个反式激活因子Tat蛋白和Rev蛋白,Tat蛋白在慢病毒基因组复制和转录延伸过程中发挥重要作用,Rev蛋白则可促使其基因的表达由早期向晚期转化HIV-1DNA前病毒的主要结构基因及其排列形式与其它逆转录病毒相同,为5LTR-gag-pro-pol-env-3LTR,其中gag基因编码病毒的核心蛋白,pol基因编码病毒复制所需的酶类,env基因编码病毒的包膜糖蛋白,pro基因则编码切割蛋白前体所需的蛋白酶慢病毒载体Lentiviralvector,LV广泛用于体外细胞的转染和基因治疗的研究目前用LV成功转染的细胞有神经细胞、视网膜感光细胞、肌细胞,肝细胞、早期胚胎细胞等,用LV制作的转基因动物有小鼠、大鼠、猪,牛等LV的优势在于1转染效率高,能够感染分裂期和静息期细胞,能转染多种组织2整合到宿主基因组中的目的基因能持久稳定的表达,不易形成嵌合体,一般能自然繁殖传代3LV经改构后,不在宿主细胞内增殖,也不会导致寄主细胞的死亡,免疫源性极小,生物安全性高LV用于转基因动物模型制备也有一定的局限性1一是制备难度较大,不易获得高滴度、高纯度的病毒2LV在宿主基因组上的整合一般是随机的,可能干扰插入位点及其附近基因表达3虽可通过控制病毒的滴度来调节转入基因的拷贝数,但是不容易实现整合拷贝数的精确控制4携带目的基因的容量较小＜10kb,当需要插入大片段DNA时,会限制制备LV的滴度5LV前病毒DNA在宿主基因上是多位点随机整合,当转基因启动子的表达需要多拷贝时应选择原核显微注射法 LV技术与siRNA结合使用,可以相对容易地在转基因动物细胞中对特定基因实现RNAi效应RNAi效应的核心是一段20-25nt的与靶基因mRNA互补或不完全互补的短RNA,通过它和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体RISC降解mRNA或阻碍其翻译要实现表达如此短的一段siRNA片段,转基因载体的长度可以控制在很合适的范围内4～5kb,对插入目的基因容量有限＜10kb的LV来说十分理想,因而LV在制备RNA干扰转基因动物模型上的优势更加明显 本实验通过慢病毒介导高效地研制了eGFP转基因小鼠,建立了慢病毒介导的转基因小鼠制备技术体系,并利用该技术制备了树突状细胞DentrenticCells,DCs特异性干扰Rab32基因表达的RNA干扰小鼠模型,进一步验证了利用该技术体系在小鼠树突状细胞实现对特定基因进行抑制的可行性与有效性 研究内容及结果 在第一部分,本课题开展了通过慢病毒载体介导、结合卵周隙显微注射、以eGFP为报告基因的转基因小鼠制备方法学研究,探讨了通过卵周隙显微注射重组慢病毒对胚胎发育的影响,以及通过此法研制转基因小鼠的效率结果1建立并优化了三质粒慢病毒包装系统,获得了滴度达到1×109TUml以上的注射用重组慢病毒通过卵周隙显微注射,胚胎的2-细胞卵裂率为81.8％11891453,与无处理组无显著差异在2-细胞期,每一视野下胚胎阳性率＞90％11781189,说明包装的病毒成功并高效地转染小鼠胚胎2将注射后发育至2-细胞的胚胎通过输卵管壶腹部穿刺移植法移植后,假孕母鼠妊娠率为42.8％1228,很大程度上避免了伞部移植法出血导致的胚胎存活率下降,提高了移植成功率3eGFP首建鼠阳性率为60.8％73120、转基因小鼠的总体研制效率转基因小鼠数注射胚胎数为5.0％731453,说明卵周隙显微注射对胚胎2-细胞卵裂率几乎无影响,表明慢病毒载体辅以卵周隙显微注射法制作转基因动物高效可行4将eGFP阳性首建小鼠采用近交方法建系,至第6个世代,荧光观察发现超排获得的胚胎全部呈eGFP阳性,且新生鼠阳性率为100％,说明eGFP基因可以通过种系传代 在第二部分,采用了基于siRNASmallinterferingRNA的RNA干扰策略、利用第一部分建立的转基因平台制作转基因小鼠模型转基因RNA干扰载体FcdGW-Rab32的表达产物siRNA-Rab32可在小鼠树突状细胞dendriticcells,DCs中特异性干扰Rab32基因,报告基因为eGFP由于DCs中并没有荧光素酶基因,构建了在DCs中特异性干扰荧光素酶基因的载体质粒FcdGW-FF3作为对照结果1FcdGW-Rab32和FcdGW-FF3组的2-细胞卵裂率分别为79.8％408511、75.8％317418,受体妊娠率分别为35.7％514、33.3％412,移植胚胎体内存活率分别为2.7％11408、2.8％9317,转基因首建鼠阳性率分别为54.5％611、66.7％69,转基因小鼠总体研制效率分别为1.2％6511、1.4％6418,除胚胎体内存活率和总体研制效率外,其他数据与第一部分的结果相当2经PCR检测和耳廓皮肤真皮层DCs荧光观察结果表明,FcdGW-Rab32和FcdGW-FF3转基因小鼠已被建立,目的基因已经正确整合至转基因小鼠基因组中,且能通过种系传代3流式细胞仪检测BMDC表明,eGFP只在小鼠的DCs内特异性表达,说明我们所采用的CD11c启动子具备较好的定向表达能力4通过相对荧光定量PCRFluorenscentQuantitativePCR,FQ-PCR对DCs的Rab32基因表达情况进行检测,结果显示Rab32基因的表达下调78.3％,特异性地实现了对DCs的Rab32基因产生Geneknock-down的干扰效应 研究结论 1.本课题成功建立了以慢病毒介导、结合卵周隙显微注射、以eGFP为报告基因的转基因小鼠制备技术体系,获得了可稳定传代的eGFP转基因小鼠,证实该技术体系有较高的转基因效率 2.将慢病毒介导的转基因动物技术与RNAi技术相结合,首次建立了在小鼠DCs特异性抑制Rab32基因的RNA干扰小鼠模型,验证了该转基因技术体系的在制备转基因小鼠模型的有效性,提示此技术路线在研究树突状细胞抗原交叉递呈的调控方面有一定的应用价值