我要检测的蛋白是100KD,配置了8%的分离胶,该用多大的电压来跑分离胶?我用了120V，但是不到一个小时就跑完了，时间短对目的蛋白的分离有没有影响？
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/28 21:16:55
我要检测的蛋白是100KD,配置了8%的分离胶,该用多大的电压来跑分离胶?我用了120V，但是不到一个小时就跑完了，时间短对目的蛋白的分离有没有影响？
我要检测的蛋白是100KD,配置了8%的分离胶,该用多大的电压来跑分离胶?
我用了120V，但是不到一个小时就跑完了，时间短对目的蛋白的分离有没有影响？
我要检测的蛋白是100KD,配置了8%的分离胶,该用多大的电压来跑分离胶?我用了120V，但是不到一个小时就跑完了，时间短对目的蛋白的分离有没有影响？
Western Blotting Protocol
1.细胞裂解
只用于western的细胞可以直接用1%SDS/PBS裂解,要用于IP,co-ip之类的实验的蛋白用裂解液I&II的方法（这个我还没有涉及到）.
1） 收细胞：贴壁细胞直接洗掉培养基,再用PBS清洗两遍后直接置于液氮中,-80°C保存.悬浮细胞低速离心2min,用PBS清洗后,直接置于液氮中,-80°C保存.
2） 加入适量的1%SDS,混匀,100°C,5-10min.13400rpm,4°C,20min.
3） 取上清于新管中.
4） 测量浓度：采用分光光度法
BCA protein Assay Reagent A：500μl
Sample:5μl
BCA protein Assay Reagent A：10μl
PS:根据蛋白的浓度曲线得到相应的浓度.
2.跑胶
配胶的protocol和咱们实验室差别不大,各人可能根据习惯对一些数据稍作调整都关系不大.
上样量：3μg-15μg,根据蛋白峰值的不同进行调整.
200V电压跑45min左右
3． 转膜（半干转）
1） 将胶小心从板上拿下来,置于transfer buffer 中（1×transfer buffer中加入20%甲醇）洗掉running buffer,15min.
2）将NC膜置于100%甲醇中激活一分钟.
3）将胶转到NC膜上,注意防止气泡（可用温度计之类的赶掉气泡）,17V恒压20min.
4）将膜转入乘有TBST的容器中（注意始终保持膜的湿润）.
5）5%的牛奶在室温blocking 1h.
4． 杂一抗
用TBST洗掉牛奶（如果一抗是溶于牛奶中则不用洗的很干净）.
PS:根据抗体特性的不同,有些抗体要溶于冷牛奶（4°C）中,有些抗体要溶于TBST中.
加入一抗,一张膜1ml就够,封于塑料封口膜中,注意赶走气泡,4°C过夜.
5． 杂二抗
用TBST洗净一抗（一抗可重复使用）,加入二抗室温1h.
6． 显色
这里用的是老式的拍照手法.
洗净二抗,准备显色液：显色液以TBST:显色液I:显色液II(咱们实验室有的那种,名字我没记下来)=2:1:1的比例配好（可根据蛋白信号的强弱调整）.
将膜侵入显色液中incubate 5min.
在暗房里拍照.
来自匹兹堡大学吴传越实验室
80-180v