关于PCR克隆基因的引物问题想拿到一个基因的CD区,CD区一共1400bp,用引物A（上游引物）,B（下游引物）扩出了1-1200bp前面一段,引物C（上游引物）,D（下游引物）扩出了1000-1400bp后面一段,可是用A
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/23 10:03:46
关于PCR克隆基因的引物问题想拿到一个基因的CD区,CD区一共1400bp,用引物A（上游引物）,B（下游引物）扩出了1-1200bp前面一段,引物C（上游引物）,D（下游引物）扩出了1000-1400bp后面一段,可是用A
关于PCR克隆基因的引物问题
想拿到一个基因的CD区,CD区一共1400bp,用引物A（上游引物）,B（下游引物）扩出了1-1200bp前面一段,引物C（上游引物）,D（下游引物）扩出了1000-1400bp后面一段,可是用A和D做引物PCR什么条带都没有,甚至连引物二聚体都没有...用primer5分析这对引物虽然得分不高,但也还算可以,毕竟这两个引物和别的引物一对的话还是能扩出来的...请大家帮忙分析一下原因,是否还有必要继续摸索条件用这对引物继续扩完整CD区...跪谢...TT
关于PCR克隆基因的引物问题想拿到一个基因的CD区,CD区一共1400bp,用引物A（上游引物）,B（下游引物）扩出了1-1200bp前面一段,引物C（上游引物）,D（下游引物）扩出了1000-1400bp后面一段,可是用A
你看,你分别获得了1-1200 nt以及1000-1400 nt这两段序列,那么中间有200 bp长度的序列是重叠的,对吧?也就是说你已经从序列信息上获得了这个CD区所有的序列信息.如果你只是需要序列信息的话,已经足够了,但是如果你需要扩增得到这完整的1400 bp用于后续的实验,那么你需要继续扩增完整的CD区.
如果这样的话,我有个小窍门,你可以把1-1200 nt以及1000-1400 nt这两个片段混合和作为模板,然后利用引物A和D进行扩增,很容易就能得到完整的1400 bp产物,不过前提是你第一步变性退火的时候,时间适当的长一些,让这两个大片段能够混合退火,即让两个片段重叠的200 bp部分能够退火,便于你扩增.
pcr反应条件呢。用引物A和D扩增时，72度延伸那步的延伸时间足够么72度延伸2分钟，温度也试过几种，都没扩出来...有可能碰到核酸高级结构难以扩增。建议使用takara的PrimeStar，特牛，使用还方便，也不很贵。我们实验室里有几个基因用Taq扩不出来，用它一扩就出来了。但它没有A尾，扩增产物不能直接连T载体。...
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pcr反应条件呢。用引物A和D扩增时，72度延伸那步的延伸时间足够么
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你可以做一下梯度pcr，效果很明显；另外你可以选用La taq酶。希望能帮到你、
如果你需要完整的CD区来做后续实验的话，那么你需要继续将CD区扩增完整。