PCR的问题最近在扩一段果蝇基因,得用CDNA做模板大概2K,60度以下扩不出来,60度以上扩出来的全是杂带.总之大家能想到的都试过,咋回事呢?那段基因引物是不是很好设,能用的都用了,26个碱基
来源:学生作业帮助网 编辑:六六作业网 时间:2024/11/26 14:44:23
PCR的问题最近在扩一段果蝇基因,得用CDNA做模板大概2K,60度以下扩不出来,60度以上扩出来的全是杂带.总之大家能想到的都试过,咋回事呢?那段基因引物是不是很好设,能用的都用了,26个碱基
PCR的问题
最近在扩一段果蝇基因,得用CDNA做模板大概2K,60度以下扩不出来,60度以上扩出来的全是杂带.总之大家能想到的都试过,咋回事呢?
那段基因引物是不是很好设,能用的都用了,26个碱基的引物,扩基因组能扩出来。克隆的基因确实是低丰度表达的。55度都扩不出来,高温的扩出来都是杂带。以前用别人的CDNA跟用我刚P的CDNA结果是一样的,据说用CDNA扩2K的片段很难。
PCR的问题最近在扩一段果蝇基因,得用CDNA做模板大概2K,60度以下扩不出来,60度以上扩出来的全是杂带.总之大家能想到的都试过,咋回事呢?那段基因引物是不是很好设,能用的都用了,26个碱基
1、跑个胶看RNA质量及有无降解,杜绝RNase的污染.
2、引物适合吗?
3、克隆的基因是低丰度表达的吗?如果是,扩增起来不是很顺利的.
4、上面都没问题的话,试着降低退火温度看看.
你参考一下,这里有RT-PCR常见问题与分析:
嗯.我是这么认为的,实验的引物、反应条件和反应体系都好解决.检测cDNA模板质量是关键.像目的基因的丰度(找到该目的片段丰度比较高的细胞来进行PCR,会有较好的效果),片段长度(长片段逆转录时逆转录酶的效率不高,建议分段扩增),RNA酶是否存在,都会影响cDNA模板质量.在保证cDNA模板质量前提下,建议从比较低的温度开始,待扩出目的片断后,再适当提高退火温度减少非特异带.别看我很懂得样子,实际做起来就是很辛苦.
引物特异性不高?
qq里说好了。
来个touch down看看,或者不要盲目的换退火温度,做个温度梯度看看
实在不行的话建议切胶回收