测序结果分析,以及RACE引物设计.求助呢我的是用简并引物扩增的未知基因的高度保守区.现在已经拿到测序结果.我首先找到了上下游引物的位置,然后把质粒DNA截掉.拿高度保守区BLAST结果出现
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/08 22:47:46
测序结果分析,以及RACE引物设计.求助呢我的是用简并引物扩增的未知基因的高度保守区.现在已经拿到测序结果.我首先找到了上下游引物的位置,然后把质粒DNA截掉.拿高度保守区BLAST结果出现
测序结果分析,以及RACE引物设计.求助呢
我的是用简并引物扩增的未知基因的高度保守区.现在已经拿到测序结果.我首先找到了上下游引物的位置,然后把质粒DNA截掉.拿高度保守区BLAST结果出现各种不同物种的的该基因,其中与模式生物的该基因100%相似.abi图谱看起来也比较靠谱.我还要做什么呢?是不是可以直接用该基因设计引物准备做RACE扩增全长了?请设计过RACE3‘和5’端特异性引物帮忙指点一下.
另外我想说,我是一个小白,之前没什么实验基础.到现在拿到了保守区.从零基础一路以来,老师也没时间指导,都是靠自己在论坛里面提问.感谢那些帮助我的朋友.让我的实验如此的顺利.基本所有实验都一次性成功.一切尽在掌握中.谢谢
测序结果分析,以及RACE引物设计.求助呢我的是用简并引物扩增的未知基因的高度保守区.现在已经拿到测序结果.我首先找到了上下游引物的位置,然后把质粒DNA截掉.拿高度保守区BLAST结果出现
先对实验对象进行诱导使你要的目的基因保证表达,然后提取总RNA,设计RACE特异性引物,5'RACE的特异性引物根据保守区靠近5‘端设计下游引物记得设计两条下游引物（模版序列的反向互补）,一条比另一条更靠近保守区的上游,这两条最好相距几个碱基,还要保证和RACE上游引物的TM值相近.先用总RNA为模板使用5‘RACE试剂盒处理RNA5’帽子随后进行反转录,然后利用RACE上游引物和你设计的靠保守区下游的下游引物进行第一轮PCR.产物作为模版以RACE上游引物和你设计的靠保守区上游的下游引物进行第二轮PCR,以第二轮PCR产物进行克隆测序.
3‘RACE的特异性引物根据保守区靠近3’端设计上游引物1条（照抄模版序列）要保证和RACE下游引物的TM接近,利用3'RACE试剂盒反转录总RNA,然后使用你设计的上游引物和RACE下游引物中的Outer进行第一轮PCR,产物作为模版以你设计的上游引物和RACE下游引物中的Inner进行第二轮PCR,以第二轮PCR产物进行克隆测序.
两轮PCR即巢式PCR,目的是更有效的避免非特异扩增,因为你模版用的是总RNA