利用RT-PCR获得目的基因时,如何鉴定有没有DNA污染?如何设计实验防止污染?
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/28 02:57:52
利用RT-PCR获得目的基因时,如何鉴定有没有DNA污染?如何设计实验防止污染?
利用RT-PCR获得目的基因时,如何鉴定有没有DNA污染?如何设计实验防止污染?
利用RT-PCR获得目的基因时,如何鉴定有没有DNA污染?如何设计实验防止污染?
测序,或者跑电泳,看看条带的位置,DNA太长了说明有污染了.
重新设计引物,不要在扩增区的中间插内含子.
也可以在RNA中加DNA酶,尝试出去DNA污染.
先电泳看看带的大小对不对，如果目的带清晰，而且没有太多的其他杂带，则可以进一步测序，如果实验室有条件的，可以在测序前，把PCR产物连接到T载体上，然后T载体去测序，测序后进行比对，看看跟扩增的是不是目的基因，如果是，从测序可以看出没有出现漏碱基或是移码之类的。
如果电泳结果出现很多杂带（包含目的带），则说明特异性不强，需要重新做PCR，把退火温度重新设定一下，一般是把退火温度调些。如果退火...
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先电泳看看带的大小对不对，如果目的带清晰，而且没有太多的其他杂带，则可以进一步测序，如果实验室有条件的，可以在测序前，把PCR产物连接到T载体上，然后T载体去测序，测序后进行比对，看看跟扩增的是不是目的基因，如果是，从测序可以看出没有出现漏碱基或是移码之类的。
如果电泳结果出现很多杂带（包含目的带），则说明特异性不强，需要重新做PCR，把退火温度重新设定一下，一般是把退火温度调些。如果退火温度调高了，还是有很多杂带，则说明你的引物特异性不强，需要再重新设计引物。
你指的DNA污染是指什么？提RNA时在最后一步时，加上DNA酶，保温一段时间，PCR时，可以做空白对照，如果边空白对照都能扩增出条带，则说明你的试剂盒或是蒸馏水污染了
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非常同意楼上的回答，补充两点：
1、跨内含子设计引物的方法的遗憾
不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。
2、DNase I处理的方法的遗憾
通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。...
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非常同意楼上的回答，补充两点：
1、跨内含子设计引物的方法的遗憾
不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。
2、DNase I处理的方法的遗憾
通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。
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