降落PCR的原理和操作过程是什么?望指教!
来源:学生作业帮助网 编辑:六六作业网 时间:2024/12/25 09:53:39
降落PCR的原理和操作过程是什么?望指教!
降落PCR的原理和操作过程是什么?望指教!
降落PCR的原理和操作过程是什么?望指教!
见百度百科
简介
降落PCR(touchdown PCR),一种PCR技术,主要用于PCR的条件的优化。在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行,例如特异性不够易错配等。退火温度过高会使PCR效率过低,但退火温度过低则会使非特异扩增过多。这虽然可以通过反复尝试来优化,但费时费力。降落PCR提供了一个较为简易的优化方法。其原理大致是这样的。首先在较高的温度下扩增,此时虽然扩增效率低,但非特异扩增基本...
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简介
降落PCR(touchdown PCR),一种PCR技术,主要用于PCR的条件的优化。在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行,例如特异性不够易错配等。退火温度过高会使PCR效率过低,但退火温度过低则会使非特异扩增过多。这虽然可以通过反复尝试来优化,但费时费力。降落PCR提供了一个较为简易的优化方法。其原理大致是这样的。首先在较高的温度下扩增,此时虽然扩增效率低,但非特异扩增基本没有。随着退火温度的降低,非特异扩增会逐步增多。但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势,因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制,从而大幅提高PCR的特异性和效率。这一PCR技术已经大量地进入医疗临床应用。现在,以高通量PCR为基础的检测方法、如人的 HLA分型 大多采用这一技术。 设计多循环反应的程序,以使相连循环的退火温度越来越低。由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值,随着循环的进行,退火温度逐渐降到Tm值,并最终低于这个水平,用于确保第一个引物—模板杂交事件发生在最互补的反应物之间,即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值,但此时目的扩增产物已开始几何扩增,在剩下的循环中处于超过任何滞后(非特异)PCR产物的地位。
编辑本段注意事项
由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对,在TD—PCR中最好应用热启动技术。设计时,退火温度的范围应跨越15℃左右,从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃。 例:一对没有简并的引物—模板的计算Tm值为62℃。 则:从65℃—>50℃(每2cycles降退火温度1℃),再在50℃退火温度下做15个循环。 实验中如持续出现假象带(杂带),则是因为起始退火温度太低,或目的扩增产物和非目的产物的Tm值相差无几,或非目的扩增物以更高的扩增效率扩增,可把退火温度每降低1℃所需的循环数增加到3或4。
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