荧光定量PCR做标准曲线,普通PCR扩增效果良好,荧光定量PCR标准曲线作图斜率只有1.02,是什么原因?引物浓度已经从0.6Ul,调整为0.8ul和1.0ul,
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/24 00:58:54
荧光定量PCR做标准曲线,普通PCR扩增效果良好,荧光定量PCR标准曲线作图斜率只有1.02,是什么原因?引物浓度已经从0.6Ul,调整为0.8ul和1.0ul,
荧光定量PCR做标准曲线,普通PCR扩增效果良好,荧光定量PCR标准曲线作图斜率只有1.02,是什么原因?
引物浓度已经从0.6Ul,调整为0.8ul和1.0ul,
荧光定量PCR做标准曲线,普通PCR扩增效果良好,荧光定量PCR标准曲线作图斜率只有1.02,是什么原因?引物浓度已经从0.6Ul,调整为0.8ul和1.0ul,
先看melt curve,斜率不对可能反应特异性不好,检查是否有非特异产物.如果是特异性问题,调整反应条件或检查引物设计.
标准曲线看斜率之前,先要看线性 （几个标准点是否在一条直线上）,关键指标是决定系数R2.如果R2在0.98以下,看斜率是没有意义的.造成标准曲线不直的原因如果是你移液技术不好,你只好重做.另一种可能是标准曲线含有一段线性区间,但在高浓度点发生弯曲.则此时有可能是你的样本含有PCR inhibitor,来源即解决办法如下：
1.可能来自反转录系统.反转录反应的成分不可避免要进入PCR,但其实反转录系统中的某些成分可能抑制PCR反应.如果为了增强信号而使用多过厂商建议分量的cDNA,则可能遇到此种问题.
2.可能来自RNA样本带有的杂质.这个可以通过260/280,260/230吸收峰比值来检查.260/280需要达到1.8以上,最好在2左右.如果样本不纯,可以考虑优化抽提步骤.
3.如果以上两个问题不存在或无法解决,就只有根据曲线的线性区间,选择可以得到线性扩增的模板用量来实验.这里面的原理是PCR inhibitor经过稀释以后作用可以减低至可以忽略.
如果标准曲线R2接近1,线性非常好,产物也特异性强,但扩增效率就是很糟,找厂商谈试剂质量问题吧.