菌落PCR做了10次还是不成功···我是第一次做菌落PCR,但是做了10次都没成功···用菌是JM83菌,在平板上培养成菌落的,做的时候就挑一点菌进体系中.我的体系是 mix 混合液（里面包含了dNTP、buff
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2025/01/25 07:42:13
菌落PCR做了10次还是不成功···我是第一次做菌落PCR,但是做了10次都没成功···用菌是JM83菌,在平板上培养成菌落的,做的时候就挑一点菌进体系中.我的体系是 mix 混合液（里面包含了dNTP、buff
菌落PCR做了10次还是不成功···
我是第一次做菌落PCR,但是做了10次都没成功···
用菌是JM83菌,在平板上培养成菌落的,做的时候就挑一点菌进体系中.
我的体系是 mix 混合液（里面包含了dNTP、buffer、Taq酶、Mg离子之类的东西）这是买来可以直接用的,但是不知道里面的含量是多少,不过据说是没问题的.
mix 混合液 10ul
Prime 1 2ul
Prime 2 2ul
ddH20 5ul
模板 1ul
模板是直接挑菌用,没有经过处理的.
然后混合好后直接就拿去P了,但是没成功过.
后来我同学说把菌体处理一下,就是沸水浴加热5min然后高速离心取上清做模板.还是不行.
后来有一次,我不小心把做感受态细胞的水当做ddH2O了,并且退火温度做了一个梯度对比,在大约50到55之间出了一点东西,是750pb的,不是我的目的片段的大小,我的目的片段大概在1300左右.那个水中mg离子浓度相当高,是80mM,里面还有20mM的Ca离子.
所以我就认为是不是mix的mg离子浓度不够,所以今天在体系中加了25mM,2.5ul的Mg离子,而ddH2O就只加了2.5ul.可是出来的结果却是Marker跑得不错,但是10个样中都只有引物···这还是没出结果···现在都不知道该怎么办了···
菌落PCR做了10次还是不成功···我是第一次做菌落PCR,但是做了10次都没成功···用菌是JM83菌,在平板上培养成菌落的,做的时候就挑一点菌进体系中.我的体系是 mix 混合液（里面包含了dNTP、buff
按你的实验体系来看你的mix是2×的吧,同时你的引物应该是5uM左右的吧?
重复你的实验,但做如下改进：
1,挑菌进500ul的ddH2O,充分混匀,不需煮,取1ul做模板,你之前直接挑菌,模板有可能过多,也会p不出带；（也可以先把克隆挑到1-5ml的LB中摇菌1小时,直接取1ul来做模板）
2,设阴性对照以及阳性对照（用有目的片段的质粒或菌为模板）,如果阳性对照能出来,而你还没p出来,就说明你的菌里没目的片段.
3,你的片段为1.3kb,如果你用的是普通taq的mix,那么你的延伸要设90s或100s才够,退火温度将梯度设在52-60℃.酶离子就别多加了.
此外,检查你的平板是不是太长时间了,抗生素失效?会造成质粒丢失,自然p不出来.
请问你怎么就确定目的片段一定连进载体了呢。。。。 这个体系引物太多了 各0.5ul足矣引物不多吧···是按照说明书配的引物···100mM的储存液稀释10倍，10mM的引物还多么····真的多了。。。关键还是你这根本就没连进去目的片段知道不。。。不是PCR的问题好吧···用了一种高保真酶，没用MIX，体系是自己配的，终于P出来了···%>_<%那估计你mix坏了。。。呵呵...
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请问你怎么就确定目的片段一定连进载体了呢。。。。 这个体系引物太多了 各0.5ul足矣
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你的菌可能不是阳性的，所以没有条带，你最好做酶切，然后连载体，最后用蓝白斑来筛选。。。菌是G-的，但是阴性菌壁比较薄···比较容易成功吧···跟你是革兰氏阴性和阳性有啥关系，所谓的阳性是没有目的条带的菌可能不存在，还不明白么。。。额····你如果确定是阳性的，那请告诉我你P菌液的目的是什么。。。= =我没做过阳性对照，不懂···不过体系自己配，换了一种高保真酶，最后终于P出来了那就好了，mix的我...
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你的菌可能不是阳性的，所以没有条带，你最好做酶切，然后连载体，最后用蓝白斑来筛选。。。
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有人用菌落做过PCR吗，假阳性高吗，怎么做的，效果怎么样啊 如果是革兰氏阴性菌比如大肠杆菌还好，阳性菌几乎不能成功，因为有很厚的胞壁没法破壁。