做定点突变PCR时,如果模板加多了,会怎么样?说明书上要求的是100ng,加了1μl,后来发现浓度是150ng/μl,这会对后续的实验有何影响?
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/27 04:43:44
做定点突变PCR时,如果模板加多了,会怎么样?说明书上要求的是100ng,加了1μl,后来发现浓度是150ng/μl,这会对后续的实验有何影响?
做定点突变PCR时,如果模板加多了,会怎么样?
说明书上要求的是100ng,加了1μl,后来发现浓度是150ng/μl,这会对后续的实验有何影响?
做定点突变PCR时,如果模板加多了,会怎么样?说明书上要求的是100ng,加了1μl,后来发现浓度是150ng/μl,这会对后续的实验有何影响?
模板多加,最大的影响就是DpnI消解模板的时候容易消解不完全,这个可以从阴性对照的平板上涨了多少菌落看出来,（阴性对照就是可实验组加同样多的模板,以及buffer和酶等等,只是不加引物,最好一起PCR,一起Dpn I消解,一起转化）.
最佳的肯定是阴性的板子一个都没长,也就说明你实验组的板子上长出来的全部是突变成功的,如果消解不完全,就看阴性的平板上菌落多不多(模板是超螺旋质粒,突变的质粒是带缺刻的,转化效率不及超螺旋状态的质粒),要是相比你实验组板子上菌落数微不足道,那也没关系,挑两个去测序,运气没那么背.
现在你是模板多加了一点,那其实完全可以在后续的步骤中补救；比如你做了25μl体系的突变PCR,那么除去取5-10μl跑个电泳确认突变引物P成功了,剩下的15μl你可以少取点(比如5μl)进行DpnI消解,并且可以增加DpnI酶的用量和反应时间,这些都可以增加完全消解模板的几率.
才多加了50ng，没问题的，本来这浓度也是一个大致的数，我pcr做的多了，基本都是靠感觉加模板量的。
如果的模板过量的话，到时候检测的结果就会改过的和没改过的同时存在改过后你所要的基因和改过前的模板基因，因为这两种情况在转化时都能长菌，PCR检测也都一样，只是在测序时才能发现有没有改。这样每次都是测序才发现，显然浪费很多宝贵的时间，所以选择合适的浓度很重要。一般20ng 就好了，20ng太少了吧？！而且做这种定D点突变PCR 的，一般在P完后不是会经过一种酶的处理吗？处理以后不就是把原模板给消化分...
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如果的模板过量的话，到时候检测的结果就会改过的和没改过的同时存在改过后你所要的基因和改过前的模板基因，因为这两种情况在转化时都能长菌，PCR检测也都一样，只是在测序时才能发现有没有改。这样每次都是测序才发现，显然浪费很多宝贵的时间，所以选择合适的浓度很重要。一般20ng 就好了，
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个人认为影响不大