试述用凯氏定氮法测定面粉中蛋白质含量的原理,简要步骤和计算公式.

试述用凯氏定氮法测定面粉中蛋白质含量的原理,简要步骤和计算公式.
试述用凯氏定氮法测定面粉中蛋白质含量的原理,简要步骤和计算公式.

试述用凯氏定氮法测定面粉中蛋白质含量的原理,简要步骤和计算公式.
测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的物理化学性质来推算,如密度、折射率、紫外吸收、荧光性等；另一类是利用化学方法来计算,如定氮、双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂反应等
主要测定方法有：双缩脲法、染料结合法、酚试剂法、紫外分光光度法、水扬酸比色法、折光法、旋光法、近红外光谱法.
目前蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法,是通过测总氮量来确定蛋白质含量的方法.
凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量,此法的结果称为粗蛋白质含量：由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物,如核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物.凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一,可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析,可同时测定多个样品,故国内外应用较为普遍,是个经典分析方法[6].至今仍被作为标准检验方法.此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定
凯氏定氮法可分为全量法、微量法及经改进后的改良凯氏定氮法目前通常以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少,且有一套微量凯氏定氮器.在凯氏法改良中主要的问题是,氮化合物中氮的完全氨化问题及缩短时间、简化操作的问题,即分解试样所用的催化剂.常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧化钛[4].
在理化实验室,检验食品中蛋白质的含量通常用微量凯氏定氮法和全量凯氏定氮法.接下来以大量的试验来比较微量凯氏定氮法和全量凯氏定氮法的精确度的大小.
1.材料与方法：
1.1试验材料
1.1.1试验样品
面粉
1.1.2试验药品和试剂
所有试剂均为分析纯；水为蒸馏水或同等纯度的水.
硫酸铜；
硫酸钾；
浓硫酸；
40％氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠溶于60mL蒸馏水中；
4％硼酸溶液：称取4g硼酸溶于蒸馏水中稀释至lOOmL；
0．1mol／L盐酸标准滴定溶液；
甲基红次甲基蓝混合指示液：将次甲基蓝乙醇溶液(1g／L)与甲基红乙醇溶液(1g／L)按1+2体积比混合.
1.1.3仪器和设备：
实验室常规仪器及下列各项：
凯氏烧瓶：500mL；
可调式电炉；蒸汽蒸馏装置；
铰肉机：
篦孔径不超过4nm；
组织捣碎机；
粉碎机；
研钵：玻璃或瓷质；
化学消化器,
凯氏定氮仪,
空气滤过器
1.2试验方法
1.2.1微量凯氏定氮法
微量凯氏定氮法的原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出,而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵.然后取消化液的1/10加碱蒸馏,使氨蒸出,用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定[2].根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量.包括消化、蒸馏、吸收、滴定四个步骤
1.2.2全量凯氏定氮法
全量凯氏定氮法的原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出,而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵.然后取消化液的全部加碱蒸馏,使氨蒸出,用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定.根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量.包括消化、蒸馏、吸收、滴定四个步骤
2 分析过程
试样制备：固体样品：取有代表性的样品至少200g,用研钵捣碎、研细；不易捣碎、研细的样品应切(剪)成细粒；干固体样品用粉碎机粉碎；液体样品：取充分混匀的液体样品至少200g.粉状样品：取有代表性的样品至少200g(如粉粒较大也应用研钵研细),混合均匀；糊状样品：取有代表性的样品至少200g,混合均匀；固液体样品：按固、液体比例,取有代表性的样品至少200g,用组织捣碎机捣碎,混合均匀；肉制品：取去除不可食部分、具有代表性的样品至少200g,用铰肉机至少铰两次,混合均匀.上述试样应放入密闭玻璃容器中,于4°C冰箱内贮存备用,尽快测定.
2.1微量凯氏定氮法的分析过程
2.1.1样品消化 :
步骤：准确称取一定量的样品,加入硫酸铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20mL、玻璃珠数粒→小心移入干燥洁净的500ml凯氏烧瓶中(固体或粉末用纸卷成纸筒送入),轻轻摇匀,以45º斜支于有小孔的石棉网上→用电炉以小火加热(或先烧瓶放在距电炉较远处),待内容物全部炭化、泡沫停止产生后→加大火力(或将烧瓶放在电炉上),保持瓶内液体微沸→至液体变蓝绿色透明后→继续加热微沸30min→关闭电炉,取下烧瓶、冷却→转移至100ml容量瓶中,加水定容
2.1.2 蒸馏与吸收：
按图安装好微量定氮蒸馏装置.于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处,加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升,以保持水呈酸性,加入数粒玻璃珠.在接受瓶中加入10ml40g/L硼酸及2滴混合指示剂,将冷凝管下端插入液面以下.准确吸取消化液10mL于反应管内,经漏斗再加入10mL氢氧化钠溶液,用少量蒸馏水冲洗漏斗,夹好漏斗夹并水封,加热煮沸水蒸气发生瓶内的水进行蒸馏.指示剂变绿色后继续蒸馏10min,将冷凝管尖端提离液面继续蒸1min