引物加了保护碱基和酶切位点(共14个碱基)后退火温度需要调整吗?
来源:学生作业帮助网 编辑:六六作业网 时间:2024/08/29 05:58:09
引物加了保护碱基和酶切位点(共14个碱基)后退火温度需要调整吗?
引物加了保护碱基和酶切位点(共14个碱基)后退火温度需要调整吗?
引物加了保护碱基和酶切位点(共14个碱基)后退火温度需要调整吗?
引物的3’端要与模板严格配对,而5’端碱基没有严格的限制,只要与模板DNA 结合的部分足够长,其5’端碱基可不与模板DNA配对而呈游离状态,这样,我们可以在引物的 5 末端加上酶切位点,因此退火温度依然取决于之前引物的退火温度.
其实加酶切位点的引物,和overlap PCR的引物原理是一样的,根本不用计算第一轮不匹配的多余碱基,至于后面的循环,原理就像是Touchdown PCR。因为温度与PCR的特异性是正比,但和PCR的效率是反比的,因此Touchdown PCR的前面的循环退火温度较高,保证了扩增的特异性,在特异的PCR产物丰度渐渐上升,就把退火温度慢慢降下来,提高扩增的效率,这种方法在模板复杂度较高(cDNA,全...
全部展开
其实加酶切位点的引物,和overlap PCR的引物原理是一样的,根本不用计算第一轮不匹配的多余碱基,至于后面的循环,原理就像是Touchdown PCR。因为温度与PCR的特异性是正比,但和PCR的效率是反比的,因此Touchdown PCR的前面的循环退火温度较高,保证了扩增的特异性,在特异的PCR产物丰度渐渐上升,就把退火温度慢慢降下来,提高扩增的效率,这种方法在模板复杂度较高(cDNA,全基因组等)的PCR中扩增低拷贝模板效果是非常不错的。当然做克隆的模板不会复杂,不计算附加碱基也不是为了做Touchdown,只是说不用担心后面扩增退火温度低造成的影响。
我是认为不用计算附加碱基,如果要调整PCR的特异性,只是提高退火温度就好了,这个提高不是以附加碱基为基础的。克隆实验倒是无所谓,如果你是要在附加碱基中加入一个小Tag等比较长的片段,计算了附加碱基,就有可能扩增不出来。
如果非要强调特异性的话,我觉得也应该最初几个循环的退火温度为不计算附加碱基的Tm,而之后就要升高为计算附加碱基的Tm。这种PCR也是有的,比如ACP-PCR(GENE Fishing)和TAIL-PCR及其几种改进方法。
收起