关于菌落pcr我的做法是： 用枪头挑选单菌落到装有10uL水的pcr管中,然后悬浮菌液. 在做 PCR 时,吸取 2uL 做摸板,但电泳检测后,选有阳性克隆相对的菌液 8uL 与试管的液体培养基中培养.这样做,
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/11/15 12:39:49
关于菌落pcr我的做法是： 用枪头挑选单菌落到装有10uL水的pcr管中,然后悬浮菌液. 在做 PCR 时,吸取 2uL 做摸板,但电泳检测后,选有阳性克隆相对的菌液 8uL 与试管的液体培养基中培养.这样做,
关于菌落pcr
我的做法是： 用枪头挑选单菌落到装有10uL水的pcr管中,然后悬浮菌液.
在做 PCR 时,吸取 2uL 做摸板,但电泳检测后,选有阳性克隆相对的菌液 8uL 与试管的液体培养基中培养.这样做, 既初步检测了阳性克隆,又保存了所需要的菌落.
但做了几次都没P出条带.
还有人说这个结果不可信,要提质粒酶切.能不能解释一下.
哪些情况假阳性.
还有实验需要注意的.
新手请教~
关于菌落pcr我的做法是： 用枪头挑选单菌落到装有10uL水的pcr管中,然后悬浮菌液. 在做 PCR 时,吸取 2uL 做摸板,但电泳检测后,选有阳性克隆相对的菌液 8uL 与试管的液体培养基中培养.这样做,
主要是不能带入AGAROSE,它是抑制PCR反应的.所以不要担心没挑到,反而更应注意别挑太多量进去,一不小心就会出假阴性.
引物也比较重要,建议引物一个为目的基因一个为载体上的
1 如果你用了插入片断特异的引物扩增，那么可能是你连接时加的目的片断过多，菌表面粘附了目的片段（我曾经在没有斑的地方蘸一下，也能P出目的带），因此很可能出现假阳性。这样验证阳性克隆时建议你
1〉用插入片断两端的测序引物（如M13F+R），做个PCR，看能否扩出目的大小的带，如果有，说明肯定有片断连入T载体；如果能用一个测序引物和一个你自己的引物扩增就更好了，不但可以确定插入的方向还可以肯定...
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1 如果你用了插入片断特异的引物扩增，那么可能是你连接时加的目的片断过多，菌表面粘附了目的片段（我曾经在没有斑的地方蘸一下，也能P出目的带），因此很可能出现假阳性。这样验证阳性克隆时建议你
1〉用插入片断两端的测序引物（如M13F+R），做个PCR，看能否扩出目的大小的带，如果有，说明肯定有片断连入T载体；如果能用一个测序引物和一个你自己的引物扩增就更好了，不但可以确定插入的方向还可以肯定是你的片断插入。
2〉可以抽出质粒后，酶切验证（这个最保险）；但是质粒很少时，用你的特异引物，进行较少循环数的扩增，如果能拿到很亮的带，那么很可能是阳性；因为提质粒后蘸附的片断会很少，而质粒作模板有利于目的基因的克隆
2 如果你的菌中质粒拷贝数很低，基因组比较复杂（如农杆菌），有时会出现假阴性（不能P出带），这时。可以提质粒后在PCR验证。
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PCR结果取决于引物的特异性，所以最好使用质粒上的引物，而不是你插入片段上的引物
我的实验室一般不做菌落PCR，一般挑上8-12个菌落直接摇菌，做菌液PCR，菌液PCR为阳性的，需要测序的话，就再提质粒，酶切，正确的，再送样品测序。
PCR结果是不可靠的，但是一般也没有很大问题。
实验室污染可能造成假阳性。
实验最重要的是有正负对照，不要污染。...
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我的实验室一般不做菌落PCR，一般挑上8-12个菌落直接摇菌，做菌液PCR，菌液PCR为阳性的，需要测序的话，就再提质粒，酶切，正确的，再送样品测序。
PCR结果是不可靠的，但是一般也没有很大问题。
实验室污染可能造成假阳性。
实验最重要的是有正负对照，不要污染。
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