pcr 一段2000多bp的基因 引物设计时 条件怎么设 包括引物长度 gc含量等 因为我用软件设计时总是设不出来 可以改哪些参数呢

pcr 一段2000多bp的基因 引物设计时 条件怎么设 包括引物长度 gc含量等 因为我用软件设计时总是设不出来 可以改哪些参数呢
pcr 一段2000多bp的基因 引物设计时 条件怎么设 包括引物长度 gc含量等 因为我用软件设计时总是设不出来 可以改哪些参数呢

pcr 一段2000多bp的基因 引物设计时 条件怎么设 包括引物长度 gc含量等 因为我用软件设计时总是设不出来 可以改哪些参数呢
没有必要那么麻烦,只要选定自己扩增的片段,从两端选18-25bp长度的序列作为引物就可以了,只要不形成典型的环,或者两条引物严重配对就可以了（50%以下就可以）最重要的是能扩增出来,别的考虑那么多也没有用,实验毕竟是试出来的.
再说现在合成引物也不贵~

PCR引物设计的法则什么的网上很多，相信你估计也已经看过了。
放轻松一点，我当时用的PP5，并不是说他设计的引物分数低了你就P不出来了，这些都不是绝对的。初次设计引物，总归不那么平静。其实，你可以请师兄师姐教教你，不耽误自己的实验进度。自己也可以尝试设计一两对引物，PCR尝试一下。因为PCR毕竟不是那么难，当然，你的题目我没看明白，如果真的要PCR的产物有2000多bp的话，也有点麻烦。像...

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PCR引物设计的法则什么的网上很多，相信你估计也已经看过了。
放轻松一点，我当时用的PP5，并不是说他设计的引物分数低了你就P不出来了，这些都不是绝对的。初次设计引物，总归不那么平静。其实，你可以请师兄师姐教教你，不耽误自己的实验进度。自己也可以尝试设计一两对引物，PCR尝试一下。因为PCR毕竟不是那么难，当然，你的题目我没看明白，如果真的要PCR的产物有2000多bp的话，也有点麻烦。像我以前做原核表达的时候，基本引物两端都固定了，也照样能P出来。
最近我一个同学做PCR，产物也有2000bp，他刚解决了这个问题，因为Mg离子浓度的问题，优化PCR条件也很重要。其实一般来说，都按照一个通用的体系，就这么做了，TaKaRa的缓冲液都是现成的，生工的还把Mg离子分开。
其实说了半天，没回答你怎么设计引物。我只想说，take it easy。。。太多条条框框没有用，我同学他们设计引物只用眼睛看就OK了，难道非要系统评分100么，当然考虑到实验成本，尽量吧，good luck。。。

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目标产物的长度一般和引物设计关系不大。设计的时候，应注意如下要点：
1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应[2]。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引...

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目标产物的长度一般和引物设计关系不大。设计的时候，应注意如下要点：
1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应[2]。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。
4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) [6][7]。
6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[6]。
7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行[8]。
8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。

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