pcr条件设定:我要p一个2000+bp的片段 pcr条件怎样设我的两个引物都是33bp GC含量为43% p过两次 都是引物二聚体

来源:学生作业帮助网 编辑:六六作业网 时间:2024/11/24 15:44:43
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pcr条件设定:我要p一个2000+bp的片段 pcr条件怎样设我的两个引物都是33bp GC含量为43% p过两次 都是引物二聚体
pcr条件设定:我要p一个2000+bp的片段 pcr条件怎样设
我的两个引物都是33bp GC含量为43% p过两次 都是引物二聚体

pcr条件设定:我要p一个2000+bp的片段 pcr条件怎样设我的两个引物都是33bp GC含量为43% p过两次 都是引物二聚体
原因分析:二聚体问题,基本可以确定为引物设计不当——你的引物很长,一般2kb的片段,有22bp的引物就足够了,你这么才长的引物,非常容易形成发夹结构,或者其他互补情况,最后形成二聚体.另外,你的引物CG含量有点低,弄到55%会稳定很多.
解决方法:首先,你应该尝试低温退火+热启动的PCR方法,具体为:首次循环加热到95度后,暂停PCR,开盖,逐个加入PCR酶,然后降低退火温度,可以做一个梯度,每次降低一度试试.如果上述方法不行,你应该重新设计引物,保证16-18个配对碱基的前提下,用软件模拟避免发卡结构和引物互补,保证GC含量在55%左右.
再P不出来,你就查你的目的基因序列去,肯定弄错序列了

标准的PCR反应体系:
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10~100pmol
模板DNA 0.1~2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L...

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标准的PCR反应体系:
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10~100pmol
模板DNA 0.1~2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
预变性的时间可以设为5min
退火温度根据引物合成单上的温度而定
延伸时间一般的TAQ酶的话是:1000bp/30s足够了
实在扩不出来就重新设计引物吧~

收起

有引物二聚体是很正常的,在引物长度大于20bp时,Tm:62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃。

pcr条件设定:我要p一个2000+bp的片段 pcr条件怎样设我的两个引物都是33bp GC含量为43% p过两次 都是引物二聚体 小片段DNA的PCR扩增程序我要扩的DNA片段138KB扩了很多次都没有扩出来,想问问大家,谁扩过这么小的片段,PCR程序是怎么设定的本人要扩增的是138bp的小DNA,怎么也扩不出来,不知道该怎么办.我的上 3400bp的基因PCR时怎样设定程序,尤其是延伸的时间?求指教 PCR技术的反应体系要如何确定试验的反应体系要如何确定?我设定了一个反应体系,但是监测不到结果, PCR 我P的是两个基因 前两个样品的目的片段是612bp 后两个是672bp 请问P出来了吗? 大片段的RT-PCR现在在做RT-PCR,目的片段5500多bp,用什么样的反应体系和条件能P出来啊?..希望知道或做过这方面实验的帮帮忙,如果p出来,下一步用什么载体连接最好,实验室里有T3、pMD19-Tps:我的 LA Taq pcr的问题我用LA Taq 扩增一个长度大概1300bp的序列 然后去测序 出了很多错配不说 还居然多了一个碱基~这是怎么回事?反应条件不合适吗? 我有一个100bp左右的目的序列,怎么设计pcr引物.还有,对于对于一个比较大的基因来说,为什么有人会从这个基因的中间设计引物,这样可以p出这个基因吗? 【Help】所p片段内含有与引物高度相似的片段该如何设计引物PCR我要P一个基因,Forward要带入一段酶切位点(XbaI),但是基因的头二十多bp的碱基和序列内500多和800多的地方分别有两个高度相似 我要做荧光定量RT-PCR,产物长度是73bp, pcr 一段2000多bp的基因 引物设计时 条件怎么设 包括引物长度 gc含量等 因为我用软件设计时总是设不出来 可以改哪些参数呢 怎样摸索PCR条件我做的 RT-PCR 以内参为对照进行条件摸索 但是就是P出不来条带 我想问在植物中提取DNA ,PCR扩增的条件如何设定呢? PCR实验BP是什么意思? 构建的质粒,菌液PCR正确,质粒电泳却什么都没有,是怎么回事?我要将一个片段连接到载体上,片段长度:2588bp,载体:2686bp,是平末端链接,4度过夜,然后转化DH5a,蓝白筛选,用菌液PCR验证,引物用的 PCR产物酶切的问题我做的是PCR-RFLP法分析SNP:引物是参照文献设计,takara合成的.订购的是takara的Taq酶.PCR 条件也是文献中的,1%琼脂糖电泳显示PCR产物大小为290bp.用文献报道的Msp I文字1μL,PCR产物 因为DNA溶度太低,PCR时我同一种DNA同时P了3管,跑电泳,条带位置却不一致.胶回收时,将上述三块胶融于一个管中,跑电泳检测时,以前大约是330bp,跑电泳却到了快600bp,连接载体,提质粒后测序,结果 pcr 条件我做了IGF-1基因5'调制区的,按照别人发的文章条件跑的PCR,自己又优化了条件,结果PCR产物经检测,有目的条带,但好像在100bp下面有一条条带,我怀疑是引物二聚体.请问各位有什么办法能