两个PCR片段的overlap 我现在需要将片段1(1900bp)和片段2(1800bp)连接起来.片段1的上下游引物分别为1a,1b.片段2的上下游引物分别为2a,2b.1b 和2a是反向互补的,约22个碱基,现在我已分别通过1a-1b,2a-2b扩
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/12/22 18:37:14
两个PCR片段的overlap 我现在需要将片段1(1900bp)和片段2(1800bp)连接起来.片段1的上下游引物分别为1a,1b.片段2的上下游引物分别为2a,2b.1b 和2a是反向互补的,约22个碱基,现在我已分别通过1a-1b,2a-2b扩
两个PCR片段的overlap
我现在需要将片段1(1900bp)和片段2(1800bp)连接起来.片段1的上下游引物分别为1a,1b.片段2的上下游引物分别为2a,2b.1b 和2a是反向互补的,约22个碱基,现在我已分别通过1a-1b,2a-2b扩增出片段1和2（酶用的是高保真酶primerstart）,并进行了胶回收,然后通过1a(Tm值：47)和2b（Tm值：49）进行overlap PCR,退火温度是40°5个循环,45°25个循环,延长时间均为4min,结果没有出现目的片段,都做了好几次了,只有引物二聚体.有一次做出来是弥散一片,是我模板加多了?财富没有了~
两个PCR片段的overlap 我现在需要将片段1(1900bp)和片段2(1800bp)连接起来.片段1的上下游引物分别为1a,1b.片段2的上下游引物分别为2a,2b.1b 和2a是反向互补的,约22个碱基,现在我已分别通过1a-1b,2a-2b扩
Overlap PCR开始几个循环模板本来就是当引物使用的,所以模板可以多加,1和2都加到100ng左右.
你没有告诉我1b(2a)的Tm,Overlap的前几个循环要考虑两个模板互补的Tm.你的退火温度太低了,特异性不够强（除非你的Taq酶对退火温度有特殊要求,这个我不知道）.
我的建议：前10个循环,用1a,1b,2b中最低的Tm做退火温度,适当延长退火时间.后25个循环用1a,2b中最低的Tm做退火温度,正常退火时间（和你Taq酶的要求有关）.你模板链长度不小,不要怕多加模板.
楼上说得很有道理。温度很低啊。
建议你先不要加引物，做10个循环（模板本身就是引物）。然后再加入引物1a和2b.
还有退火温度比TM低5度，40度那步不要。可以换成49度5个循环。你好，谢谢你的答案。那我在前面10个循环加酶吗？我看到网上有说不加酶。还有就是一共只做15个循环码？加酶。只做15循环肯定不够的。那我先做10个循环，然后加入1a,2b，再扩增49°25个循环，可以吗？先...
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楼上说得很有道理。温度很低啊。
建议你先不要加引物，做10个循环（模板本身就是引物）。然后再加入引物1a和2b.
还有退火温度比TM低5度，40度那步不要。可以换成49度5个循环。
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